aiuto per clonaggio con vettore T-end e amlicone PCR blunt

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Autore

Discussione

Elisa Elisa
Nuovo Arrivato

1 Messaggi

Inserito il - 25 settembre 2010 : 23:21:40

ciao a tutti.
io devo fare un clonaggio e vorrei sapere come fare per a creare l'amplicone che finisca con le codine di adenina visto che uso il pGEM-T easy vector che prevede le t-end mentre il mio amplicone teoricamente, � un blunt-end. ho letto che ci sono delle TaqPolimerasi nelle mastermix che "agganciano" la A finale all'amplicone: io uso quella della DIagenode ma non riesco proprio a trovare nulla in riferimento a tale caratteristica. qualcuno di voi pu� aiutarmi? grazie

SpemannOrganizer
Utente

Citt�: Los Angeles

955 Messaggi

Inserito il - 26 settembre 2010 : 16:21:55

ma guarda, in teoria tutte le polimerasi NON proof reading (che non siano High fidelity insomma) tendono ad agganciare le adenine alla fine del filamento sintetizzato. Quindi una normale Taq polimerasi dovrebbe fare al caso tuo. (In alternativa, se vuoi essere certa di nn avere errori durante la replicazione del DNA, puoi usare una mistura Taq/proof reading polymerase, considerando per� che la Taq deve essere di molto in eccesso). In genere, viene consigliato di aggiungere delle guanine al 5' dei primer (per esempio Primer Forward: 5' GGXXXXXXXXX 3'e primer Reverse 5'GGXXXXXXXXX 3')perch� ci� aumenta la probabilit� che la Taq aggiunga le adenine.

puoi trovare info utili qui:
http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/topota_man.pdf

oppure qui:

http://hcgs.unh.edu/protocol/basic/Cltaclone.html

saluti

biologomolecolare84
Nuovo Arrivato

Prov.: Rm
Citt�: Roma

69 Messaggi

Inserito il - 18 gennaio 2011 : 11:36:31

Ciao...mi inserisco in questa discussione perch� dovrei acquistare il pGEM-T Vector (non Easy). Scusate la domanda forse per alcuni ovvia...ma posso produrre il vettore e utilizzarlo per ulteriori clonaggi anche se ha le T protundenti? E' affidabile?