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str3gh3tta
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 23 febbraio 2017 : 10:37:21
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Buongiorno a tutti...scusate, forse per alcuni sarà una cosa banale...ma io nn riesco proprio a farmi entrare in testa questa cosa:
Io mi ricavo l'anello linfocitario dopo centrifugazione, ne prelevo 50 microlitri e li metto in 450 microlitri di colorante Turk, poi prelevo una piccola quantità per andare a contare le cellule al microscopio con la camera di Thoma. Ad esempio ne abbiamo contate 7.
Adesso come faccio a portare a 3 milioni? E a 10 milioni? (Devo diluire con PBS)
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Caffey
Utente Attivo
Città: Perugia
1496 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2017 : 20:49:00
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Ciao! Sì, è banale e proprio per questo è frequente che nessuno te lo spieghi quando cominci a lavorare in laboratorio.
Sostanzialmente ogni camera di conta (si dice così in italiano...?) contiene un piccolissimo volume di liquido nel quale sono sospese le cellule.
Prendiamo ad esempio la tua camera Thoma con 7 cellule. Non so queste 7 cellule in quale dei volumi identificati dalla camera si trovino, ma ipotizziamo che siano nel quadratone grande centrale o in uno di quelli agli angoli (che sono uguali). La camera è progettata perché tra il vetrino coprioggetto e il vetro della camera vera e propria ci sia uno spessore di 0,1mm e il quadratone in questione ha un lato di 1 mm. Ne deriva che il volume contenuto in questo spazio è pari a 1 x 1 x 0,1 = 0,1 mm3.
Se in 0,1 mm3 ci sono 7 cellule, quante ce ne sono in 1 ml? Anche qui la risposta è molto banale: 1 ml = 1 cm3 = 1000 mm3, quindi 1000 mm3 / 0,1 mm3 = 10000, ovvero il tuo volume è 10000 volte inferiore ad 1 ml e quindi devi moltiplicare il numero delle tue cellule per 10000, più comunemente si scrive 10^4. Hai 70.000 cellule/ml.
Tuttavia devi ricordarti che hai diluito il tuo campione con il colorante 1:10 (50 uL in 450 uL), quindi in realtà il campione che hai contato è 10 volte più diluito rispetto al medium con le cellule originario, perciò devi moltiplicare il tuo valore ulteriormente per 10, ottenendo 700.000 cellule/ml = 7x10^5 cell/ml.
Adesso ipotizziamo che vuoi portare la concentrazione a 3 milioni (3x10^6) cell/ml. Naturalmente devi sapere quante sono in totale le tue cellule, semplicemente moltiplicando il numero per il volume totale in ml che hai. Se ipotizziamo che hai 10 ml di volume: 7x10^5 cell/ml x 10 ml = 7x10^6 cell, ovvero 7 milioni di cellule.
Chiaramente, dovendo creare una sospensione più concentrata non puoi fare altro che centrifugare le cellule e risospenderle in un volume inferiore che è pari a...?
Prova tu e facci sapere. Ovviamente chiedi pure chiarimenti se qualcosa non è chiaro!
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str3gh3tta
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 25 febbraio 2017 : 09:26:33
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| Tra alcuni conti trovati in lab ho visto qst (contate 6 cell): 6×5/30=1ml; 6×5/100=0.3=300microlitri (aggiungo 700PBS=1ml); nel 2 conto ho visto ke aggiungono, ma nel 1 quanto aggiungono? |
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Caffey
Utente Attivo
Città: Perugia
1496 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2017 : 17:07:29
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Citazione:
Messaggio inserito da str3gh3tta
Tra alcuni conti trovati in lab ho visto qst (contate 6 cell): 6×5/30=1ml; 6×5/100=0.3=300microlitri (aggiungo 700PBS=1ml); nel 2 conto ho visto ke aggiungono, ma nel 1 quanto aggiungono?
Mi dispiace ma sinceramente non riesco a capire che cosa siano quei calcoli. Forse semplicemente la banale formula CixVi=CfxVf ma senza unità di misura non ci capisco niente. |
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