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brambifix
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
 Inserito il - 12 febbraio 2018 : 15:53:27
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Buongiorno, devo fare un analisi western blot per quantificare una determinata proteina che è espressa molto poco, anche con un secondario HRP e femto ECL non riesco ad aver dei segnali puliti il più delle volte. Posso amplificare il segnale emesso da un anticorpo fluorescente, esistono anticorpi secondari con più fluorocromi attaccati, che cosa mi consigliereste in una situazione infelice come questa?
Grazie 
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2018 : 19:51:56
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| Intanto non hai modo di arricchire il campione per la tua proteina? Tipo tramite frazionamento cellulare, dissezione o microdissezione, concentrazione etc? |
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brambifix
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
Inserito il - 13 febbraio 2018 : 09:40:40
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| No purtroppo, non si parla di cellule ma di esosomi (lisati e non) e ne ho una aliquota di 500Ul per tre diversi frazionamenti con SEC. per quanto riguarda il campione ho le mani legate e anche cercare di coltivare più cellule non porta a miglioramenti. |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 13 febbraio 2018 : 19:54:32
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Pff...ho lavorato sugli esosomi per un periodo...sono una rottura...
Purtroppo credo che le uniche due opzioni siano:
- partire da un volume maggiore di terreno
- cambiare tecnica di purificazione (non so se stai facendo centrifugazione, ma vendono un sacco di kit a riguardo)
- trovare un anticorpo primario con una maggiore affinità |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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brambifix
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
Inserito il - 15 febbraio 2018 : 09:50:43
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La tecnica di purificazione consiste in una concentrazione in centrifuga e una cromatografia SEC, secondo me aumentare il volume di terreno porta sola ad avere un campione più diluito, tanto per la raccolta lascio le cellule per 24h in quel terreno, quindi la frazione di esosomi rilasciati non penso che cambi considerevolmente con ancora più terreno. Si effettivamente ci sono parecchie difficoltà con ste nanoparticles.
Grazie dei consigli |
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amplificazione segnale quantificazione proteina
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