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ChEyEnNe
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
 Inserito il - 08 novembre 2007 : 13:15:17
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Salve ragazzi
dopo le varie prove fatte con anticorpi e traferimenti da gel a membrana, continuo ad avere sempre lo stesso problema con le mie proteine
spiego in breve: semino le mie cellule su mw da 24 o 96, liso e poi vado a leggere in assorbanza. cosa ottengo? valori in assorbanza molto bassi, tali da non avere neanche 1µg di proteine totali. carico il pozzetto del gel con circa 30µl della mia soluzione (dove teoricamente dovrei avere proteine totali). faccio la corsa elettroforetica, trasferimento, IAb, IIAb, chemiluminescenza e mi ritrovo una sovra saturazione della mia proteina
allora faccio diversi tentativi, sia sui lavaggi, sugli anticorpi, sui tempi tra i vari passaggi ma niente. Il risultato è sempre quello. Dopo la lettura in assorbanza, ho sempre pochissime proteine ma allora perchè poi me ne ritrovo così tante alla fine dell'esperimento?
Mi viene suggerito di usare il GAPDH. Leggo, mi informo, ma non capisco come e perchè usare questo enzina. Mi sapreste dare qualche delucidazione sul lato pratico del GAPDH + western blot?
grazie in anticipo
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 08 novembre 2007 : 22:24:01
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GAPDH è semplicemente un housekeeping. Io l'ho sempre visto usare per la PCR ma immagino tu lo possa anche usare in western. Di solito io per il western blotting usavo actina o tubulina per normalizzare i valori dei campioni.
Il fatto che tu abbia poche proteine ma bande ultrasature potrebbe essere dovuto al fatto che hai un anticorpo molto affine alla tua proteina. Io proverei a caricare un volume minore, diluire di più gli anticorpi, aumentare la lunghezza dei lavaggi, diminuire il tempo di esposizione (ovviamente cambiando un parametro alla volta). |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 08 novembre 2007 : 23:01:50
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| secondo me non è possibile che ti ritrovi così poche proteine in assorbanza. sei sicuro di quantizzarle in modo corretto? io per risolvere il problema punterei a quello step dell'esperimento. |
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Nastia
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 07 agosto 2011 : 10:01:30
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Hai provato a cambiare la macchina che legge l'assorbanza?
Cmq, c'e' un modo per misurare la concentrazione di GAPDH direttamente nei pozzetti dove cresci le cellule. Si toglie il brodo di coltura e si aggiunge un buffer di lisi contenente un particolare colorante direttamente sulle cellule, a secondo dell'intensita' del colore puoi giudicare se la proteina molta o poca. E semplicemente un metodo diverso dalla lettura dell'assorbanza, ma non e' preciso, approssimativo. |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 07 agosto 2011 : 14:05:54
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Citazione:
vado a leggere in assorbanza. cosa ottengo?
non ho capito in che modo esegui il dosaggio delle proteine, non usi un saggio colorimetrico? Potresti darci qualche informazione in più?
(Penso che esegui male questo passaggio)
Citazione:
faccio la corsa elettroforetica, trasferimento, IAb, IIAb, chemiluminescenza e mi ritrovo una sovra saturazione della mia proteina
puoi caricare per es 5ul di campione e/o diluire gli ab e/o diluire il tempo di esposizione.
Giusto per citarti qualche dato io incubavo con un ab primario policlonale diluito 1/50000 (1uL in 50mL). |
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