Salve , sono nuova di questo forum ma, tante volte ho trovato la soluzione ai miei problemi. Spero di poter essere utile anche io. La mia domanda è un dubbio amletico che mi assila da giorni. Ho estratto L'RNA totale da una linea cellulare di cheratinociti umani, il rapporto 260/280 non è altissimo ma il mio RNA su gel risulta non essere degradato. Ammesso anche che io l'abbia sovrastimato, in real time ottengo dei plot di amplificazione ottimi per l'housekeeping e praticamente segnale inesistente per il mio target. Ho usato una sonda TaqMan scelta dopo accurata ricerca bibliografica e che era stata utilizzata su epidermide ricostituita. Se il mio RNA fosse poco o mal estratto non dovrei neanche vedere l'housekeepin giusto? Posso giungere alla conclusione che quel gene non sia espresso se non sotto stimolazione? Ho provato anche con delle curve standard e non amplifica nulla... Aiutatemi vi prego. Ho solo tanta teoria e poca pratica e devo cavarnmela da sola perchè mi hanno chimato qui per questo!!!
Neanch'io sono molto esperto (sto imparando). Mi viene da pensare. Non puoi portarti un controllo positivo (tipo le stesse cellule stimolate)?!?! Così puoi dimostrare che il primer funziona correttamente, che l'estrazione è avvenuta bene e che semplicemente non c'è l'Rna...