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silvietta82
Utente Junior
126 Messaggi |
 Inserito il - 02 settembre 2011 : 12:28:40
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Ciao a tutti, sto facendo prove di estrazione del DNA da campioni di siero....dal momento che le quantità di DNA estratte sono probabilmente molto basse devo eseguire delle real time PCR di prova(con cybr green. su geni a caso) per valutare l'efficenza del metodo di estrazione ...
Ho già estratto ed eseguito alcune real time ma non so come interpretare i cicli soglia e come ricavare da quelli l'efficienza d'estrazione. Aiutatemi vi prego :D.
Esempio:
nei controlli in cui metto H2O al posto del DNA il ciclo soglia è 35
nel campioni varia: 22, 26,27, 29, 30, 35 (approssimativamente)
FINO A QUALE VALORE POSSO CONSIDERARE L'AMPLIFICATO SPECIFICO??
E DA QUALE VALORE IN POI??
COME POSSO CONSIDERARE L'EFFICENZA DEL METODO?
E' POSSIBILE CALCOLARE LA CONCENTRAZIONE INIZIALE DAL CICLO SOGLIA?
Se mi risolvete anche solo uno di questi dilemmi ve ne sono grata fin d'ora :)
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picchiasebino
Nuovo Arrivato
Città: roma
52 Messaggi |
Inserito il - 05 settembre 2011 : 16:31:00
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Una cosa mi risulta strana: il controllo negativo con H2O come fa ad uscire a 35?
Nonostante che consideri i quantitativi di DNA estratto molto basse, io prima proverei ad una quantificazione in spettrofotometria o fluorimetria x dare una prima valutazione quantitativa e di qualità 260/280 dei DNA. questo x evitare i costi alti della PCR realtime. la quantificazione ti permetterebbe inoltre di normalizzare le concentrazioni e aspettarti delle uscite conformi o simili tra loro dei campioni.
L'ideale sarebbe avere dei campioni di controllo di qualità (quality controls) da comprare e già estratti che diluiti a tuo piacimento e sottoposti al tuo saggio ti diano delle uscite verificate.
in questo modo puoi confrontare il tuo metodo di estrazione con quello automatizzato dei quality control.
Una volta che si pensa di aver trovato un metodo buono di estrazione bisogna estrarre più campioni contemporaneamente, quantificarli, normalizzarli e metterli in PCR e stimare una riproducibiltà del metodo.
Infine un controllo della purezza del DNA e dell'efficienza di PCR dovrebbe essere stimata diluendo i campioni di prova con fattore noto (es 1:10) o più diluizioni seriali x verificare che i delta ct tra il diluito e non diluito sia rispettata. Es. se un campione esce a 25, il diluito 1:10 dovrà uscire a 28,3 circa.
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