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cellulina84
Nuovo Arrivato

1 Messaggi

Inserito il - 07 novembre 2011 : 14:35:26

Buongiorno a tutti!!Avrei un problema da risolvere e vi chiedo aiuto...Premetto che lavoro da poco tempo in biologia molecolare quindi devo chiarirmi alcuni dubbi: quando preparo la mix per la RT-PCR è strettamente necessario vortexare ciò che utilizzo per preparare la mix? Perchè nel laboratorio dove ho svolto la tesi mi facevano "agitare" bene le provettine con dei colpettini delle dita per miscelare il prodotto, una volta scongelato, e poi spinnare brevemente, spero si sia capito :-)...il non vortexare mi potrebbe causare problemi nella RT-PCR e di conseguenza nella Pre-amplificazione e nella Real-Time, per esempio diminuzione significativa dell'amplificato?! In particolare cosa si può spinnare senza problemi tra buffer, dNTPs, Primer pool, enzima trascrittasi e RNasi inibitore?!
Vi ringrazio tanto in anticipo!!

GFPina
Moderatore

Città: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 07 novembre 2011 : 19:20:47

Quando scongeli qualcosa (non solo reagenti per la real-time) è sempre bene vortexare per far si che il reagente sia ben disciolto e miscelato e non ci siano errori nel pipettaggio dovuti ad una diversa concentrazione presente all'interno della provetta non ben agitata.
Vortexare in genere è meglio rispetto a picchiettare la provetta.
Dopo di che è buona regola dare una breve spinnata in modo da raccogliere sul fondo tutto il liquido che vortexando è andato sul bordo della provetta.
L'unica cosa che in genere non viene vortexata sono gli enzimi (ad es. la Taq) che si trovano in una soluzione contenete glicerolo e che quindi non congelano, votexandoli violentemente si potrebbero rovinare (poi in realtà su questo punto ci sono diverse scuole di pensiero)

N.B. RT-PCR non sta per real-time PCR ma per RetroTrascrizione seguita da PCR.