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Mat
Nuovo Arrivato
85 Messaggi |
 Inserito il - 27 febbraio 2013 : 15:34:59
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Salve, ho un problema con la rela time.
Premetto, in inizio autunno (ottobre) si è scongelato il freezer con gli enzimi (naturalmente durante il weekend per le leggi di murphy)ma non ho dovuto fare real fino ad adesso. Ho imbastito un esperimento di prova per verficare gli enzimi (iSCRIPT per la retro e EvaGreen per la real time). La retrotrscrizione sembra funzionare ma a real ha dei prblemi. Sulla base di un vecchio esperimento ho caricato 5ng di cDNA da RT(concentrazione 1ng/microlitro quindi 5 microlitri)e 10 microlitri di enzima. Fatto una rela time secondo un protocollo standard presene in lab e l'houskeeping usato (B2M per la precisione9 viene fuori a 28 cicli... un po' tanto per essere un housekeeping.
Secondo voi può essere che abbiamo caricato poco campione o che l'enzima non funziona più bene?
Spererei sinceramente la prima opzione ma sono pronto a riordinare l'enzima (anche se mi seccherebbe buttare quello in uso in quanto ce ne è ancora abbastanza).
Grazie a tutti.
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 27 febbraio 2013 : 22:55:30
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Gli housekeeping possono uscire a tutti i cicli, in realtà dovresti usare un housekeeping che esce vicino al tuo gene di interesse. Comunque, già provato B2M su quella linea cellulare e su quel trattamento? esce sempre a 28? Qualcuno ti può prestare un po' di enzima nuovo?! così puoi provare il tuo enzima e un altro sullo stesso campione di cDNA e vedere se l'efficienza è diversa e di quanto lo è.
Personalmente credo che uno scongelamento non riduce l'efficienza del tuo enzima dal 100% allo 0%, e comunque se hai perso un po' di efficienza degli enzimi sarà identica in tutte le wells, quindi l'errore si azzera (ovviamente se devi vedere piccole differenze fra i campioni, o se devi vedere cose che escono vicino ai 35 cicli il discorso cambia) |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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Mat
Nuovo Arrivato
85 Messaggi |
Inserito il - 28 febbraio 2013 : 22:28:32
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| Su quella linea cellulare in genere B2M ci usciva a 18-20 cicli, il nostro gene di interesse 26-28, ora il nostro gene di interesse esce a 31 B2M a 28, su una seconda real di prova gene 30, B2M 26 cicli. Mi riferisco a dati vecchi pre-scongelameto per il confronto, sono da poco in questo lab e quindi mi affido ai dati e l'esperienza di chi ci lavora da più tempo. |
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