PCR per genoma completo HPV

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tatyrew
Nuovo Arrivato

Prov.: Lodi
Città: graffignana

2 Messaggi

Inserito il - 02 aprile 2007 : 11:19:07

ciao a tutti..vorrei avere alcuni consigli per fare una PCR che amplifichi il genoma completo di HPV, lungo circa 7800 pb..
ho gia' selezionato ed acquistato i primer specifici, comprato una mix adatta (Pfu Ultra con 50mM Tris-HCl; 1mM DTT; 0.1 mM EDTA; 0.1% Tween 20; 0.1% Igepal e 50 % glicerolo0. Inoltre la [Mg2+] e' pari a 2mM, [dNTPs]= 1mM.
Le temperarture della PCR sono le seguenti(secondo protocollo): 95* x 2 min;[(95*x 20 sec) (Tm 55*x20 sec) (72*x2min)]x 30 cicli;72*x3 min.
Ho provato piu' volte ma non mi esce nulla..inoltre purtroppo, non ho controlli positivi.
Qualcuno ha esperienza?
Grazie
Tatiana Garlaschi

RM
Nuovo Arrivato

115 Messaggi

Inserito il - 02 aprile 2007 : 21:59:36

Ciao
2 min di extension sembrano pochi per un prodotto di 7800 bp. In genere la regola dovrebbe essere di circa 1min/Kb. Ci sono molte cose che potresti fare. Puoi provare a: aumentare l'extension a 7-8 min, diminuire la T e il tempo di denaturazione (es. 94°C x 10 sec) ma soprattutto fare un titolazione con [mg2+](da 1.5 fino a 5 mM).Quanto è alta la % di GC? se > 60 puoi provare con DMSO (5% finale). Un gene così lungo comunque non è semplice da amplificare e richiede un pò di ottimizzazione.

tatyrew
Nuovo Arrivato

Prov.: Lodi
Città: graffignana

2 Messaggi

Inserito il - 03 aprile 2007 : 15:17:39

oggi ho cambiato di nuovo le temperature..sia di extention che la Tm..inoltre ho provato a cambiare la [Mg]..sono in attesa..
grazie mille.
Tatiana

Bernardi
Nuovo Arrivato

Prov.: Siena
Città: Siena

14 Messaggi

Inserito il - 09 maggio 2007 : 15:40:07

ciao penso che ti convenga fare una specie di fingerprint perchè così non so se ci riesciad amplificare quell'enormità, ma potrei sapere perchè hai bisogno dell'intero gene?
dall'ultima risposta hai detto che hai cambiato la conc di Mg ma hai provato a fare una curva di concentrazioni? e una curva di temperature di melting?
l'idea del DMSO è ok

silvia927
Nuovo Arrivato

Prov.: toscana

25 Messaggi

Inserito il - 10 maggio 2007 : 09:30:41

Ciao..volevo informarvi che da diverso tempo è in commercio un nuovo kit per la ricerca e la tipizzazione dell'HPV elaborato dalla Digene. Non so esattamente come come si esegua nella pratica ma so di certo che vengono utilizzate 2 sonde ibridizzate con Ag di superficie rispettivamente dei ceppi ad alto e basso rischio di trasformazione maligna (già preparate e consegnate col kit) che consentono di avere una risposta decisamente più veloce di quella in PCR e sicuramente meno elaborata..

inoltre..lo so per esperienza è altrettanto affidabile e meno costosa!!

...per informazioni visitate il sito www.digene.it!!

"...L'aria del paradiso è quella che soffia dentro la criniera di un cavallo..."