Protocollo - Estrazione DNA da sangue intero

Estrazione DNA da sangue intero

Descrizione

Questo protocollo può essere utilizzato per estrarre DNA da sangue intero, fresco o congelato, o da buffy coat.

Mettere 5ml sangue in una provetta da 50ml

Aggiungere 15 ml di RCL Solution e agitare delicatamente per inversione per 10 minuti (non vortexare!)

Centrifugare a 3500 rpm (875xg) per 10 min

Eliminare il surnatante facendo attenzione che non si stacchi il pellet

Risospendere il pellet agitando su vorte

Consiglio

se necessario eseguire un secondo lavaggio con altri 15 ml di RCL Solution

Aggiungere 5 ml di WCL Solution e vortexare per assicurarsi che le cellule siano lisate completamente

Incubare e 37°C per 30 min

Aggiungere 2,6 ml di Protein Precipitation Solution e vortexare vigorosamente per almeno 25sec

Centrifugare a 13000 rpm (12000xg) per 10 min

Recuperare il surnatante che contiene il DNA in una provetta da 50ml

Aggiungere 2 volumi di Etanolo Assoluto a RT, agitare per inversione fino alla formazione del gomitolo

Centrifugare a 3500 rpm (875xg) per 5min per far precipitare il gomitolo

Eliminare l'etanolo assoluto e lasciar asciugare la provetta rovesciata su carta da banco

Aggiungere 3ml di Etanolo 70% freddo

Centrifugare a 3500 rpm (875xg) per 5min

Eliminare l'etanolo 70% e lasciar asciugare la provetta rovesciata su carta da banco

Dissolvere il DNA in H2Odist. sterile o TE da 200 a 600 µl a seconda della grandezza del gomitolo

Lasciar sciogliere il DNA o.n. a +4°C