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 Biologia Molecolare
 disegnare primers su trascritto primario
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maedea
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Inserito il - 04 novembre 2011 : 18:10:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di maedea Invia a maedea un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao ragazzi!

Dovrei fare uno studio di espressione di diverse isoforme di un gene di interesse, attraverso l'uso di primers isoforma-specifici. Poichè la coding sequence di alcune di queste isoforme è interamente contenuta in quella di isoforme più lunghe, secondo voi ha senso disegnare dei primers che si appaiano al trascritto primario anzichè a quello maturo? Rischio di ottenere una misura di espressione non corrispondente alla realtà?

SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 04 novembre 2011 : 18:21:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
non credo che risolveresti il problema, perchè primers basati sul trascritto primario non ti permetterebbero comunque di distinguere le isoforme che da questo sono espresse (inoltre, quanto di questo trascritto primario viene sottoposto a splicing e matura in mRNA? potrebbe benissmo non esserci una corrispondenza diretta tra trascritto primario e mRNA).

Hai pensato a fare un northern per monitorare l'espressione delle varie isoforme?

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maedea
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24 Messaggi

Inserito il - 04 novembre 2011 : 18:38:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di maedea Invia a maedea un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sì, al northern ci abbiamo pensato ma, non occupandoci di biologia molecolare, non abbiamo molta esperienza in questo campo. Lavorare con la Real time ci è più semplice.
Forse parlando di trascritto primario non mi sono espressa correttamente: faccio riferimento al fatto che, quando cerco su NCBI, ottengo una sequenza nucleotidica che è più lunga rispetto alla effettiva CDS (perchè contenente gli UTR) e sulla quale però potrei basarmi per discriminare tra le diverse isoforme. Riformulo la mia domanda più precisamente: è sbagliato disegnare dei primers sugli UTR?
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 04 novembre 2011 : 21:07:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ok, ora è molto + chiaro :). Io avevo capito infatti trascritto non maturato (splicing)che è la definizione spicciola di trascritto primario. Se le varie isoforme differiscono l'una dall'altra per la UTR, perchè no? puoi benissimo disegnare i primers sulla base di queste sequenze che costituiranno quindi il tuo discriminante. Quindi ti chiedo: sei sicura che le sequenze delle varie isoforme differiscano nelle UTR?

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maedea
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24 Messaggi

Inserito il - 07 novembre 2011 : 10:23:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di maedea Invia a maedea un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sì, almeno per alcune ci sono differenze nelle UTR. Volevo avere conferma che fosse opportuno disegnarvi i primers, perchè qualcuno mi aveva insinuato il dubbio! Grazie mille!
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