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clo86
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 Inserito il - 25 gennaio 2012 : 19:05:52
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ciao a tutti, avevo una domanda da sottoporvi!
sto analizzando un articolo il cui scopo è quello di confrontare il proteoma di individui affetti da leismaniosi e individui presi come controllo, e individuare le proteina espresse in maniera differente o in quantità differenti. premetto che il materiale di partenza è siero, per cui viene preventivamente fatta una deplezione delle componenti maggioritarie.
nel lavoro procedono facendo innanzitutto una DIGE, poi le proteine differenzialmente espresse vengono identificate mediante spettrometria MS in tandem.
vorrei sapere secondo voi, quale potrebbe essere un metodo alternativo, per ottenere lo stesso risultato.
potrebbe essere il microarray proteico oppure l'utilizzo di marcature quali l'ICAT??
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
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 Inserito il - 25 gennaio 2012 : 19:24:29
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Messaggio inserito da clo86
ciao a tutti, avevo una domanda da sottoporvi!
sto analizzando un articolo il cui scopo è quello di confrontare il proteoma di individui affetti da leismaniosi e individui presi come controllo, e individuare le proteina espresse in maniera differente o in quantità differenti. premetto che il materiale di partenza è siero, per cui viene preventivamente fatta una deplezione delle componenti maggioritarie.
nel lavoro procedono facendo innanzitutto una DIGE, poi le proteine differenzialmente espresse vengono identificate mediante spettrometria MS in tandem.
vorrei sapere secondo voi, quale potrebbe essere un metodo alternativo, per ottenere lo stesso risultato.
potrebbe essere il microarray proteico oppure l'utilizzo di marcature quali l'ICAT??
Decisamente si. Mi sembrano anche più rapidi e "facili" manualmente da mettere in atto, visto che per l'ICAT si tratta solo di taggare delle frazioni proteiche e poi mettere in massa come per la DIGE. Ancora meglio, si opta per una LC-MS di modo da aumentare la risoluzione. La DIGE rispetto alle normali 2D è un'invenzione mirabile: riduce la variabilità tra campioni proteici permettendoti di caricare nello stesso gel fino a tre (o quattro?) campioni diversi, resta tuttavia laborioso prelevare gli spot d'interesse. C'è di buono che puoi scegliere il metodo di ionizzazione (ESI o MALDI), mentre con ICAT ionizzi ESI, dato che devi fare una cromatografia praticamente per forza, e per grandi proteine avresti una marea di ioni che difficilmente lo spettrometro risolverà.
Di microarray non ne so un granché, ma non vedo perché non si possa usare. Che genere di microarray faresti pero'? |
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clo86
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Inserito il - 25 gennaio 2012 : 19:36:20
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Infatti in realtà non è chiaro neanche a me il microarray, so che si può fare quello in cui vai a depositare tanti tipi diversi di anticorpi, vedi cosa si lega e rilevi e quantifichi mediante fluorescenza, però nn c'ho capito molto...
invece vorrei farti un'altra domanda, lo shotgun non si potrebbe utilizzare vero??? perchè non ho capito bene in cosa consiste, quindi non so è applicabile al mio caso, me lo potresti spiegare brevemente? io ho capito che si fa un'HPLC (cromatografia liquida ad alta prestazione) e poi anche qui MS/MS...è così? |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
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Inserito il - 25 gennaio 2012 : 19:47:30
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Nelle procedure classiche di identificazione via spettrometro di massa si fa precedere l'inserimento del campione nello spettrometro una analisi elettroforetica bidimensionale: come sai dal gel 2D vengono prelevati solo gli spot di interesse, perché variano di posizione o di intensità, suggerendo una qualche variazione dell'espressione proteica e/o modifiche post-trad, in seguito ad uno stimolo. Nella shotgun proteomics invece si salta a priori l'analisi su gel e si analizza in spettrometria di massa un pool di proteine ben più ampio rispetto a quello che hai in uno spot da gel 2D. Il campione è cosi' ampio che l'analisi spettrometrica deve esser preceduta da una cromatografia HPLC, di norma in almeno due fasi (scambio ionico e inverse phase) di modo da suddividere il campione iniziale in tanti pacchetti di proteine, più facilmente risolvibili dalla strumentazione.
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clo86
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Inserito il - 25 gennaio 2012 : 20:21:38
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ok credo di aver capito, quindi in realtà si potrebbe fare anche lo shotgun però la DIGE è la più appropriata e accurata per l'analisi differenziale...
e se dicessi invece Peptide Mass Fingerprint??
prendo la miscela proteica, digerisco con tripsina, i peptidi li analizzo mediante MALDI-TOF o LC/MS e poi faccio MS/MS?? cosi ottengo le masse dei singoli peptidi e li confronto con banche dati in cui ci sono masse ottenute sperimentalmente da stessa disgestione triptica che utilizzo nel mio esperimento? |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
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Inserito il - 25 gennaio 2012 : 21:28:35
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Citazione:
Messaggio inserito da clo86
cosi ottengo le masse dei singoli peptidi e li confronto con banche dati in cui ci sono masse ottenute sperimentalmente da stessa disgestione triptica che utilizzo nel mio esperimento?
C'è un errore di fondo grave qui, attento/a: le masse che ottieni vengono raffrontate alle masse ottenute da proteine tripsinizzate VIRTUALMENTE e facenti parte di una banca dati. Nel senso che il software che userai per fare il peptide fingerprinting ti chiederà con quale enzima hai tagliato le tue proteine e a questa punto prenderà le sequenze di tutte le proteine presenti nel database (in realtà dovrebbero essere le traduzioni di cDNA, dato che di sequenziamento proteico se ne fa poco) e per ognuna di esse individuerà quali peptidi essa dà quando sottoposta ad una determinata proteasi. Se decidi di tagliare con tripsina, per il software dividerà la proteina in svariati peptidi lì dove è presente una lisina o arginina, salvo che essa sia seguita da una prolina (perché la tripsina non taglierebbe in questo caso). Puoi inoltre affinare l'analisi inserendo il numero di missed-cleavage: insomma, solo in un mondo ideale il tuo enzima proteolitico taglierà ovunque trova la sua sequenza, da ciò segue che nella realtà ci saranno frammenti di dimensione superiori a quelli teorici. No? Puoi dire al software: guarda, sussiste la possibilità che la proteasi non tagli, all'interno della proteina, in due punti in cui dovrebbe (ossia due missed-cleavage). Il programma perciò prenderà in considerazione ciò, non escludendo frammenti di massa superiore a quelli ottenibili tagliando ovunque.
Ciò che conta è l'idea che le proteine nel database sono in realtà traduzioni di cDNA e che esse vengono tagliate VIRTUALMENTE dal software che utilizzi. |
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clo86
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Inserito il - 25 gennaio 2012 : 22:05:32
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ok ho capito perfettamente, ti ringrazio tantissimo sei stata molto chiara!
io non so se è la stanchezza o se è perchè l esame è vicino ma nn ho capito una cosa, anche dopo la DIGE nell'articolo dicono che fanno LC-MS/MS. significa che con la DIGE io ottengo la mappa, vedo la proteina espressa in maniera diversa e mi prendo qst spot. lo spot a questo punto si digerisce con tripsina e la miscela peptidica si manda in cromatografia liquida, e man mano che esce l'eluito va direttamente allo spettrometro? che quindi sarà sicuramente un ESI-MS? e poi faccio una prima MS che mi seleziona gli ioni, e una seconda che mi frammenta questi ioni e mi da lo spettro di massa?
sono molto confusa ora come ora  |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
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Inserito il - 25 gennaio 2012 : 22:13:33
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Citazione:
Messaggio inserito da clo86
ok ho capito perfettamente, ti ringrazio tantissimo sei stata molto chiara!
io non so se è la stanchezza o se è perchè l esame è vicino ma nn ho capito una cosa, anche dopo la DIGE nell'articolo dicono che fanno LC-MS/MS. significa che con la DIGE io ottengo la mappa, vedo la proteina espressa in maniera diversa e mi prendo qst spot. lo spot a questo punto si digerisce con tripsina e la miscela peptidica si manda in cromatografia liquida, e man mano che esce l'eluito va direttamente allo spettrometro? che quindi sarà sicuramente un ESI-MS?
Tutto giusto fin qui. Se passi da LC a MS senza altri passaggi è un ESI, di certo non può essere un MALDI.
Per la parte non quotata di messaggio letto così mi pare giusto, ma domani pomeriggio te lo so dire con certezza. Purtroppo ora sono un po' stanco e domani mattina sono ad un ciclo di conferenze. Comunque rileggendo mi pare proprio di si.
1- scansioni, guardi lo spettro e decidi lo ione che ti interessa
2- filtri tutti gli ioni salvo quello con l' m/z di interesse (magari in una trappola ionica preceduta da un quadrupolo) e poi all'interno della trappola frammenti. I frammenti poi vengono inviati ad un secondo quadrupolo per fare la scansione ed avere l' m/z che userai per l'identificazione via software |
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clo86
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Inserito il - 25 gennaio 2012 : 22:20:45
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ti ringrazio davvero tanto, mi hai risolto dei dubbi tremendi, grazie davvero per la tua gentilezza e disponibilità!!!  |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 23:30:23
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Citazione:
Messaggio inserito da clo86
ti ringrazio davvero tanto, mi hai risolto dei dubbi tremendi, grazie davvero per la tua gentilezza e disponibilità!!!
Figurati, non mi è costato nulla e la Proteomica è una mia grande passione, quindi ne scrivo con piacere. In bocca al lupo per l'esame.
Per renderti più chiare le idee, ti invito a riflettere su questa slide:
Immagine:
27,85 KB
PS: il ragazzo nella foto, quello che addenta quella bellissima ragazza urlante, beh quel ragazzo è 0barra1. |
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clo86
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Inserito il - 25 gennaio 2012 : 23:41:40
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ahahaahah grazie ragazzo nella foto, che addenta quella bellissima ragazza urlante!! io sono ancora sul MIO CARO articolo, e dato che sei un appassionato, ti farò spero un'ultima domanda, rispondi tranquillamente anche domani, dopodomani magari no perchè ho l'esame!!
nell'articolo dopo che dice di aver fatto la DIGE, dice che è stato fatto un gel preparativo usando un pool di proteine, colorate con blu di coomassie, gli spot di interesse sono presi manualmente e sottoposti a tripsina. i peptidi derivanti sono utilizzati per la LC-MS/MS.
ma sto gel preparativo è fatto con un nuovo pool di nuova preparazione, o utilizza i prodotti separati precedentemente dalla DIGE,presi dallo spot differenziale??? se fosse così, la colorazione fluorescente Cy che fine fa???
eheheh sono un disastro...
grazie ancora tanto!!!  |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 23:59:24
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Forse, FORSE, si riferisce al fatto che è stato realizzato un secondo gel 2D, "normale" questa volta, da cui sono stati prelevati gli spot di interessi, scelti in riferimento all'analisi DIGE. D'altronde lo schema di distribuzione degli spot nel gel rimane la stessa, quindi basandosi sulla DIGE si può pensare di prelevare dall'altro gel uno spot che contenga le stesse proteine al suo interno. Una sorta di copia carbone insomma.
Questo forse per evitare di avere tra le scatole i fluorofori, che possono andare incontro a rottura al posto dei backbones proteici. E per sapere che spot raccogliere, dato che non sono più messi in evidenza dai fluorofori, il gel preparativo viene colorato con blue coomassie. Coomassie colloidale oltretutto, ossia per rilevare concentrazioni abbastanza basse.
Un altro problema dei fluorofori è che nonostante siano pensati per mantenere il pI della proteina non derivatizzata, ne alterano comunque il peso molecolare, di circa 500 Da. Se dunque la posizione nell'IEF è identica per proteine derivatizzate con fluoroforo e non derivatizzate, ciò non è più vero dopo la SDS-PAGE. Ora, questo è importante perché a quanto mi era stato detto, normalmente si usa poco fluoroforo, con il risultato che la maggior parte della proteina è in forma non-derivatizzata e quando si preleva si deve prestare attenzione al fatto che lo spot vero, quello contenente la proteina "naturale" è leggermente spostato rispetto al punto fluorescente. Magari per ragioni che ignoro tutte queste considerazioni hanno spinto gli sperimentatori a fare un secondo gel.
Altro non mi viene in mente. |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
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Inserito il - 29 gennaio 2012 : 18:49:55
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| Com'è andata? |
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clo86
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
Inserito il - 29 gennaio 2012 : 19:01:28
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Qualcosa l'ho buttata giù, attendo i risultati, sarai tra le prime persone a saperlo!!! 
il tuo aiuto è stato prezioso!!! |
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