In situ hybridization radioattiva
Descrizione
Questa tecnica permette di identificare la presenza di un certo mRNA a livello di un tessuto facendo ibridare una sonda radioattiva su sottili fettine di tessuto.
Questo protocollo richiede l'utilizzo di materiale radioattivo e quindi tutti i passaggi devono essere eseguiti in un ambiente opportunamente predisposto. È buona norma tenere un contatore Geiger sull'area di lavoro per controllare che nei vari passaggi non ci siano state perdite di materiale radioattivo.Questa metodica può essere fatta sia su fettine "free-floating" sia su fettine già fissate su vetrini. Nel primo caso sarà necessario tagliare fettine di 15-30 µm da tessuto fissato in paraformaldeide con un microtomo; le fettine saranno lasciate galleggiare nei vari buffer fino alla parte finale dell'esperimento. Nel secondo caso invece, il tessuto (fresh-frozen o fissato) sarà tagliato con un criostato e le fettine saranno direttamente messe su vetrini. In questo caso i vetrini andranno immersi nelle varie soluzioni.
La metodica free floating garantisce un migliore accesso della probe al tessuto, oltre ad un notevole risparmio di reagenti (i volumi usati sono molto minori). Tuttavia questo metodo è più laborioso e richiede più attenzione per non far danneggiare le fettine.Pre-ibridazione (lavorare in ambiente RNAsi free. Tutte le soluzioni devono essere state trattate con DEPC e la vetreria passata in stufa)Fissare i tessuti in 4% paraformaldeide per 10' a RT.Lavare 3 volte a RT in 0.5X SSCIncubare in trietanolammina 0.1M con 0.25% anidride acetica, per 10' a RT.Incubare in 1% Triton X-100 in PBS per 30' a RT.Lavare 3 volte per 5' con 2X SSC a RT.Incubare in buffer di ibridazione (senza probe) a 42ºC, 2 ore (oppure o/n). Se si stanno usando fettine su vetrini, mettere una goccia di buffer su ogni fettina e mettere i vetrini in una camera umidificata con 5X SSCConsiglio
Il buffer di ibridazione è molto viscoso, ma quando messo a 42º diventa molto liquido. È quindi possibile che dopo un po' si distribuisca su tutto il vetrino. Fare molta attenzione soprattutto nel prossimo passaggio, quando si aggiunge la probe radioattiva, perchè si potrebbero avere perdite di materiale radioattivo.
Ibridazione (ATTENZIONE!!!! Materiale radioattivo!)Precipitare la probe radioattiva (sintetizzata secondo questo protocollo) e risospenderla in ~10 µl di TE. Scaldare a 80ºC e lasciare brevemente raffreddare.Dissolvere la probe nel buffer di ibridazione in cui sono le fettine, ad una concentrazione di 300000 cpm/sezione di tessuto (questo per cervello di topo, per tessuti più grandi si può aumentare la concentrazione)Incubare a 55ºC o/n (o anche per 2-3 giorni)Lavaggi (non serve più essere in ambiente RNAsi free)Sciacquare velocemente in 2X SSC con 10mM ß-mercapto etanolo e 1mM EDTA scaldato a 55ºC (scarto radioattivo).Lavare 2 volte per 10' in in 2X SSC con 10mM ß-mercapto etanolo e 1mM EDTA a RT (scarto radioattivo).Trattare con 20 µg/ml RNAsi in buffer per RNAsi per 30' a RT (scarto radioattivo).Lavare 2 volte per 10' in in 2X SSC con 10mM ß-mercapto etanolo e 1mM EDTA a RT (scarto radioattivo).Lavare 2 volte per 1h in 0.1X SSC con 10mM ß-mercapto etanolo e 1mM EDTA a 55ºCLavare 2 volte per 10' in 0.5X SSC a RT.Se si sta lavorando con fettine free floating, a questo punto montarle su vetrini.Consiglio
A questo punto è possibile fare un controstaining usando, ad esempio,
blu di bromofenolo o coloranti simili, per meglio visualizzare le cellule alla fine del processo.
