Stripping di membrane di Western Blotting

Descrizione

Una volta rilevata una certa proteina da una membrana di nitrocellulosa di un Western blotting, è possibile riutilizzare questa membrana per l'analisi di un altra proteina.
È quindi necessario rimuovere gli anticorpi legati alla membrana (processo detto stripping) e riincubarla con il nuovo anticorpo.
È possibile eseguire lo stripping più volte, ma generalmente dopo 2 o 3 il segnale diventa molto debole e si comincia ad avere molto rumore di fondo.

  • Incubare la membrana a 50 ºC per 30 minuti in stripping buffer



  • Consiglio
    A questo punto si può trattare la membrana come in seguito al blotting.



  • Incubare in 5% BSA o latte in PBS + 0.1% Tween 20 (PBS-T)


  • Lavare 3 volte per 5-10 minuti con PBS-T


  • Incubare sullo shaker con l'anticorpo primario a 4 ºC overnight o 1-2 ore a T ambiente.


  • Lavare 3 volte per 5-10 minuti con PBS-T


  • Incubare sullo shaker con l'anticorpo secondario 1 ora a T ambiente.


  • Lavare 3 volte per 5-10 minuti con PBS-T


  • Procedere con il rilevamento