Trasformazione per Heat Shock
Descrizione
Protocollo per trasformare batteri resi competenti con CaCl2 attraverso shock termico.
Consiglio
Utilizzare materiale sterile.
A 100 μl di cellule competenti ( se a -80°C lasciare scongelare lentamente posandole in ghiaccio) aggiungere 1-10 ng di DNA ( se proviene da una mini prep utilizzare 0.5-1 μl )Incubare in ghiaccio per 30 min.PASSAGGIO IMPORTANTE
Incubare a 42°C ( 37°C per ceppi termo sensibili) per 40 sec. (2 min. per i ceppi a 37°C). Riporre in ghiaccio per 2 min.Aggiungere 0.8 ml di LB precedentemente riscaldato (42°C o 37°C ) e incubare a 37°C (o 30°C) per 30 min.Centrifugare per 30 sec. in Eppendorf ed eliminare 0.8 ml di LB, quindi risospendere le cellule nel volume rimasto.Piastrare 1/10 e 9/10 del volume in due piastre di agar contenenti gli opportuni antibiotici.Crescere a 37°C O.N. ( o a 30°C) , capovolte.Consiglio
Per ogni esperimento occorre allestire anche un controllo negativo in cui non si aggiunge DNA.
Per calcolare l'Efficienza di Trasformazione
Contare le colonie ottenute, moltiplicare per la diluizione di piastratura.
Dividere per i ng di DNA utilizzato
Efficienza di trasformazione (CFU/μg)=n°colonie /μgDNA
