Problemi: trasfezione e colorazione recettore I.F.

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tiz83
Nuovo Arrivato

Citt�: smallville

72 Messaggi

Inserito il - 18 settembre 2009 : 19:46:17

Salve a tutti...sono in piena crisi...ho due enormi problemi...
Il primo � una trasfezione (con Superfect) nelle cellule MCF-7 sulle cui cellule effettuo il saggio della luciferasi. Infatti, vi trasfetto un DNA che a monte ha il gene reporter della luciferasi..e poi normalizzo con la beta-gal. In pratica, voglio valutare una attivit� trascrizionale...Il problema � che allo spettofotometro (utilizziamo modello Tecan) non ho colpi molto alti (diciamo 100-max200) quando invece l'anno scorso con gli stessi DNA avevo circa 12000. Ho assodato che lo strumento non � rotto (� venuto apposta il tecnico!!!!), la mia betagal diviene a malapena giallina (quasi bianca con valori 0.06 --> in altri tipi di cellule la stessa betagal diviene gialla..solo nella mia!!!Io vi trasfetto 0.5 gamma...e penso sia un problema di tarsfezione...Ho fatto di tutto (anche time course della trasfezione!!) non so' pi� dove andare a parare....
2 Problema: colorazione recettore del progesterone nelle T47D
Queste cellule sono veramente dannate...Quando faccio la bromodeossiuridina per vedere se vanno in fase S non mi si colora pi� nulla e la colorazione del recettore accoppiata alla trasfezione � un vero dramma...Io utilizzo l'Ab PgR 3176 della Cell Signaling rabbit e per vedre una cosa decente lo devo usare non diluito come primario (immaginate che nella boccettina escono solo 100 microlitri...!)e l'Ab II ogni volta che lo uso mi d� problemi.

Se qualcuno lavora con queste cellule e ha avuto esperienze simili mi potrebbe aiutare???
Grazie mille ma sono veramente disperata!!!!

Non c'� immensit� che valga quanto abbiamo vissuto.
Pablo Neruda

lucarosso86
Nuovo Arrivato

3 Messaggi

Inserito il - 12 giugno 2011 : 20:41:16

ciao, io avevo lo stesso problema e alla fine si � scoperto che il mio plasmide si era degradato (l'ho corso sul gel). Quindi ti posso consigliare di ricrescere il plasmide in nuove cellule competenti ed estrarlo di nuovo.
Io uso fugene e prima di usarlo lo lascio a temperatura ambiente per tipo 10, 20 minuti (nn deve essere freddo altrimenti nada)
per ultimo so che sembra stupido, ma nn conservare i lisati in freezer perch� il segnale perde di brutto, se proprio nn riesci a misurarli all'istante conserva i campioni a - 80
spero di averti aiutato un pochino