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raiden1
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
 Inserito il - 04 luglio 2007 : 18:03:42
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Ciao a tutti!
Volevo avere qualche info sul gateway system Es: come funziona perche si usa ecc ecc... perchè in rete ho trovato poco ed anche sul sito della invitrogen non ci ho capito molto!
GRAZIE A TUTTI!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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raiden1
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 10 luglio 2007 : 20:17:56
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Ragazi ho visto i vari siti ma sostanzialmente non ci ho capito molto se non che si utilizza la ricombinazione omologa del fago lambda!
C'è per caso qualche anima pia che mi può spiegare in modo ab esaudiente di ke si tratta xkè viene utilizzato ecc ecc...
Vi ringrazio!!
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Aureus
Utente Junior
Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola
123 Messaggi |
Inserito il - 10 luglio 2007 : 21:21:38
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Il sistema Gateway è ottimo per trasportare e studiare un prodotto di PCR, un GENE di tuo interesse, e tutto quello che è DNA ds da un vettore all'altro...
...la ricombinazione avviene tramite i Siti ATT...
...oppure tu puoi inserire il tuo ds DNA in vettori che lo permettano, cioè, che abbiano con una Topoisomerasi direttamente attaccata al plasmide entry...
Comunque...
Alla tua proteina puoi attaccare ad esempio una molecola di GFP (o un TAG qualsiasi), direttamente fusa con la tua prooteina di interesse per localizzarla all'interno delle cellule dopo una trasfezione
...oppure trasportarla facilmente in un plasmide che possa indurti la tua proteina, per averne grandi quantità e magari produrre anticorpi...
...oppure puoi fare librerie geniche...
...ecc...
Comunque è inutile che mi dilungo ...
...nel sito dell'invitrogen se cerchi bene troverai tutti i manuali Gateway che spiegano le potenzialità di questa tecnica.
Questo è un esempio:
http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/pcr8gwtopo_man.pdf
Se cerchi bene nel sito troverai anche tutti gli impiegni della tecnica
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Clonare non è mai stato così semplice.
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Ciao
-Lorenzo- |
www.tlbspazio.it
Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 11 luglio 2007 : 22:37:23
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Vediamo se riesco a spiegarlo in parole semplici... (per le figure però riguarda i siti che ho postato)
Il Sistema Gateway è semplicemente un sistema di clonaggio più facile e veloce rispetto al metodo che utilizza gli enzimi di restrizione.
Sfrutta la "ricombinazione sito-specifica" fago lambda (cioè il processo con cui il fago lambda si può integrare nel genoma di Coli)
Fago lambda e E. Coli
Il fago lambda contiene la sequenza "attP" mentre E. coli ha la sequenza "attB" grazie a due enzimi ( Int (integrase) e IHF (host integration factor)) può avvenire ricombinazione tra queste due sequenze e il fago lambda si integra in Coli.
l-----attP----attP-----l......l-------attB------attB-------l
l......FAGO LAMBDA.....l......l..............E. COLI...............l
l----------------------l.......l----------------------------l
l--------attL-----------------attR--------l
l................E. COLI + LAMBDA................l
l------------------------------------------l
quando avviene l’integrazione al posto di attP e attB si formano due nuove sequenze attL e attR.
La reazione può anche avvenire al contrario (grazie alle proteine Int, IHF e Xis (excisionase)), avviene ricombinazione tra attL and attR e il fago lambda si excide dal DNA di Coli. Si riformano le sequenze originali di attP nel fago lambda e attB in Coli.
Gateway
Questo processo è stato sfruttato dalla tecnologia Gateway:
ad es. tu vuoi clonare il tuo gene A
- ti vendono dei vettori che hanno la sequenza attP (chiamati “Donor Vector”)
- tu produci ad es. mediante PCR la sequenza codificante del il gene A fiancheggiata da due sequenze attB:
attB---Gene A--- attB
- fai avvenire ricombinazione attB x attP e ottieni il tue gene A all’interno del vettore, a questo punto il tuo gene sarà fiancheggiato dalla sequenza attL. (il vettore che si forma si chiama “Entry Clone”)
Adesso poniamo che tu voglia far esprimere il gene A in cellule di mammifero:
- compri un vettore per espressione in cellule di mammifero (chiamato “Destination Vector”), questo contiene la sequenza attR.
- fai avvenire la ricombinazione attL x attR tra il tuo “entry vector” col gene A e il “Destination Vector”
- ottieni un “Expression Clone” che puoi far esprimere in cellule di mammifero
Poi poniamo che tu voglia farlo invece esprimere in Coli (ad es. per fargli produrre la proteina A):
riutilizzi il tuo “Entry Clone-A”
- compri un “Destination Vector” per espressione in cellule di Coli
- fai avvenire la ricombinazione attL x attR tra il tuo “Entry Clone-A” e il “Destination Vector”
- ottieni un “Expression Clone” per l’espressione del gene A in Coli
Puoi anche tornare indietro:
Dal tuo “Expression Clone” che ha il tuo gene fiancheggiato dalle sequenze attB (nota: esattamente come il prodotto di PCR da cui sei partito) puoi far avvenire una ricombinazione attB x attP con un “Donor Vector” e ottieni ancora l’“Entry Clone”
E’ un sistema molto facile e versatile per questo viene usato.
Poi ci sono varie modificazioni di questo sistema.
I vettori che utilizzi ad es. possono contenere anche delle sequenze per esprimere proteine di fusione (sia in N che in C terminale).
Contengono anche dei siti di clonaggio multipli (Multiple cloning site) che ti permettono anche di inserire il frammento nel vettore per clonaggio classico con enzimi di restrizione (ad es tu hai un vettore già fatto con enzimi di restrizione e puoi inserirlo in un vettore Gateway)
Spero così ti sia più chiaro! 
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raiden1
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 12 luglio 2007 : 00:33:57
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| Siete mitici!!Vi ringrazio davvero!!! |
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maurizio85
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2011 : 17:04:21
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| dopo tante ricerche in rete ho trovato finalmente una spiegazione chiara del SISTEMA GATEWAY. grazie per le vostre spiegazioni e non solo in questo caso... |
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2011 : 19:40:12
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NOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO!!!!!!
HO PASSATO UN ORA PER FARE QUESTO POST CON TUTTI I DISEGNINI E QUANDO HO FATTO INVIA, SI è RIFORMATTATO TUTTO......
PER PRINCIPIO MI RIFIUTO DI EDITARLO, LO LASCERò COSì, INCOMPRENSIBILE.
Voglio aggiungere che è stata anche implementa una nuova variante (con cui sto attualmente lavorando) che è il GATEWAY MULTISITE SYSTEM, attraverso il quale è possibile assemblare più entry clones in una volta sola, sfruttando siti di ricomb. ingegnerizzati.
ammettiamo che voglia creare questo costrutto:
----PROMOTORE X---GENE Y---IRES--MCHERRY---POLYA-------
per PCR amplifico i miei frammenti, utilizzo primers contenenti codine con siti di ricombinazione ingegnerizzati, ottenendo:
attB1-PROMOTOREX-attB4
attP4-GENE Y-IRES-MCHERRY-attp3
attB3-POLYA-attB2
con ogniuno di questi creo l'entry clone corrispettivo attraverso la reazione BP.
creati gli entry, li prendo e li butto tutti assieme ricombinandoli con il vettore destination finale:
attR1-PROMOTOREX-attR4 attR3-POLYA-attR2
\ \ / /
\ \ / /
\ attL4-GENE Y-IRES-MCHERRY-attL3 /
\ /
\ /
attL1------------------- DESTINATION ----------------attL2
inoltre tutti i plasmidi che non ricombinano esprimono un gene di selezione negativa, che è il ccdb, questo gene blocca la girasi batterica e non fa crescere le colonie. Nel momento in cui il vettore viene ricombinato o per creare l entry o per creare il destination finale, viene perso questo frammento e le uniche colonie che cresceranno su piastra saranno quelle col plasmide ricombinato.
attB2--amplificato PCR---attB2
X -------> attR1---amplificato PCR---attR2
attP1--gene del ccdb--- attP2 CRESCE
MUORE |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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Patrizio
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Inserito il - 07 luglio 2011 : 21:17:17
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| zerhos pensavo 4 anni |
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GFPina
Moderatore
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