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Kuradia
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 Inserito il - 20 luglio 2011 : 18:09:12
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Salve a tutti, avrei bisogno di una 'consultazione' riguardo i western blot, e in particolare la parte che riguarda la corsa elettroforetica...ho notato che durante la corsa le bande assumono una forma stranissima, all'inizio si fanno tipo ad 'erbetta', ma poi 'i fili d'erba' ( XD scusate non so spiegarlo) si allungano sempre di più durante la corsa, in pratica una banda è come costituita da tante strisce verticali! A qualcuno di voi è mai successo? Sapete dirmi il perchè? Il voltaggio che imposto è di 200V, è troppo alto? E uso dei gel precast... Grazie in anticipo
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
 Inserito il - 20 luglio 2011 : 20:40:51
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Citazione:
Messaggio inserito da Kuradia
Salve a tutti, avrei bisogno di una 'consultazione' riguardo i western blot, e in particolare la parte che riguarda la corsa elettroforetica...ho notato che durante la corsa le bande assumono una forma stranissima, all'inizio si fanno tipo ad 'erbetta', ma poi 'i fili d'erba' ( XD scusate non so spiegarlo) si allungano sempre di più durante la corsa, in pratica una banda è come costituita da tante strisce verticali! A qualcuno di voi è mai successo? Sapete dirmi il perchè? Il voltaggio che imposto è di 200V, è troppo alto? E uso dei gel precast... Grazie in anticipo
Una foto anche fatta col cell sarebbe cosa simpatica. Ma di che bande parli? durante la corsa si vede solo il colorante che avanza le bande le vedi quando sviluppi la lastra, oppure se colori il gel o il blot. 200v mi sembra molto alto se non ricordo male per un gel delle dimensioni standard, (quello della cameretta biorad) si corre 120-140V.
Queste strisce verticali sono di colore diverso? per caso giallo? |
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Kuradia
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
Inserito il - 20 luglio 2011 : 22:07:01
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Sì vabbè, io mi riferivo alla forma che assume il colorante durante la corsa nel gel :)...nelle istruzioni del macchinario c'è scritto di usare quel voltaggio per questo ho fatto così...comunque ecco la foto, e grazie di aver risposto :)
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2011 : 02:11:41
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| umh strano ma forse c'è come una tela di fili di acrilamminde nel lume dei pozzetti di caricamento? |
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Kuradia
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2011 : 09:00:25
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| Uhm, i gel sono precast...io sciacquo la cameretta dietro i pozzetti con acqua distillata e poi lo sbatto un po' per far andare via l'acqua dai pozzetti e facendo ciò li osservo bene, sono ben delineati, non ci sono residui nè cose strane. Ho guardato il manuale di istruzioni e alla sezione 'problemi' dicono che se durante la corsa ci sono strisce verticali il campione è troppo concentrato..=_= ma io prima di caricare faccio il dosaggio, non faccio mica di testa mia, quindi mi pare strano...poi quando parla di bande irregolari dice che potrebbero essere dovute a sale nel campione, ma io uso un lysis buffer di protocollo, ho letto anche in giro e non mi pare che il mio abbia una molarità superiore al normale. Non riesco proprio a capire...grazie ancora comunque! |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2011 : 18:59:52
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| Potrebbe essere anche il leamminig che usi per caricare, io ho usato i precasted mentre lavoaravo in Germania, un modo per ottenere risultati peggiori spendendo di più. Tuttavia se ci fosse della acrilammide nel pozzetto te ne accorgeresti mentre carichi. Fai imbbibire bene il gel prima di correre i campioni, magari anche facendo un breve prerunnig prima di caricare i campioni a voltaggio basso |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2011 : 21:03:12
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Ma che precast e che buffer usi?
Comunque a me qualche volta, su alcuni campioni non tutti però, è capitato con i gel precast dell'Invitrogen corsi in MES. Può succedere in effetti in alcuni campioni molto concentrati o con molti sali. Però nel mio caso migrava male il fronte del colorante ma le bande erano belle, tu hai provato a fare un Coomassie per vedere come sono i tuoi campioni dopo SDS-PAGE? |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 22 luglio 2011 : 15:19:18
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Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
Ma che precast e che buffer usi?
Comunque a me qualche volta, su alcuni campioni non tutti però, è capitato con i gel precast dell'Invitrogen corsi in MES. Può succedere in effetti in alcuni campioni molto concentrati o con molti sali. Però nel mio caso migrava male il fronte del colorante ma le bande erano belle, tu hai provato a fare un Coomassie per vedere come sono i tuoi campioni dopo SDS-PAGE?
a me captava che virava il fronte da blu a giallo, significa che nel gel il pH era diferente (acido) da quello che dovevva essere. Puoi aggiungere un liato controllon PBS + inibitori delle proteasi cosi vedi se fà quello schifo |
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Kuradia
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
Inserito il - 23 luglio 2011 : 10:49:20
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Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
Ma che precast e che buffer usi?
Comunque a me qualche volta, su alcuni campioni non tutti però, è capitato con i gel precast dell'Invitrogen corsi in MES. Può succedere in effetti in alcuni campioni molto concentrati o con molti sali. Però nel mio caso migrava male il fronte del colorante ma le bande erano belle, tu hai provato a fare un Coomassie per vedere come sono i tuoi campioni dopo SDS-PAGE?
Tutti prodotti della bio-rad uso...guarda, non ho provato a colorare la membrana, però ho fatto direttamente i trattamento con gli anticorpi e lo sviluppo sulla lastrina fotografica. Il risultato è che le bande sono tutte uguali, solo che a guardarle bene molto da vicino, si vede che hanno la superficie leggermente frastagliata (certo non come la schifezza che si vedeva nel gel, ma comunque non belle 'lisce')...anch'io pensavo al fatto che il campione fosse troppo concentrato...se ci aggiungessi un po' di lysis buffer oltre al semple buffer? |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 23 luglio 2011 : 13:28:26
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Messaggio inserito da Kuradia
[quote]Messaggio inserito da GFPina
Ma che precast e che buffer usi?
...anch'io pensavo al fatto che il campione fosse troppo concentrato...se ci aggiungessi un po' di lysis buffer oltre al semple buffer?
ma anche H2O scusa quando fai i calcoli, che usi leamming 5X o 2X ? ti fai due conti e lo diluisci. Ma scusa non hai quantizzato il campione? quanti ug di proteine carichi? che buffer di lisi hai utilizzato? |
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Corsa elettroforetica con bande irregolari
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