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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
 Inserito il - 24 ottobre 2011 : 15:14:05
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Cari tutti,
sto riscontrando un problema con questo anticorpo secondario (anti-rabbit per la precisione), che porta il fluorocromo 350 alexa fluor, che da colore blu, simile al dapi. Lo spettro di eccitazione/emissione è simile a quello del DAPI, quindi ho pensato che si potesse visualizzare con lo stesso filtro del dapi. Sapete confermarmi se è questo il filtro giusto o se la mia considerazione è sbagliata?
Infine, a che diluizione lo usate? L'ho usato 1:1000, stessa diluizione degli altri secondari (quindi 2 ug/mL). Va detto che l'aliquotina che ho usato era stata congelata e scongelata una volta, forse anche questo può avere influito. Grazie a chi mi saprà rispondere!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2011 : 17:47:24
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Allora, DAPI e Alexa 350 hanno praticamente lo stesso spettro, quindi molto probabilmente non è un problema di filtro.
In generale io i secondari li uso sempre attorno a 1:1000/1:2000
Citazione:
Va detto che l'aliquotina che ho usato era stata congelata e scongelata una volta, forse anche questo può avere influito.
Può darsi... Noi per evitare il problema, e risparmiarci di aliquotare gli anticorpi li diluiamo sempre 1/2 in glicerolo. In questo modo non hai bisogno di aliquotarli e non hai problemi di frosting/defrosting (non arrivano a congelarsi nel -20)
L'altra opzione è che il problema sia il primario. Prova a fare un test veloce con un secondario diverso e vedi cosa succede. Inoltre ricorda che in genere i fluorofori blu non sono molto brillanti, quindi a volte bisogna alzare un po' le [].
PS: immagino che in tutto ciò si stia parlando di immunoistochimica, giusto? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2011 : 17:58:17
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immunofluorescenza.
Infatti non avevo quasi dubbi sul filtro, però mi chiedo cosa diavolo sia successo. Sai, il primario è un rabbit anti GFP che ho usato + e + volte quindi escluderei che sia quello. In un vetrino avevo uno staining particolarmente forte di GFP (ho usato la fluorescenza endogena, come secondario infatti ho usato solo l'alexa 350) che mi pareva di vedere il corrispettivo in blu. Però non sono molto sicuro. Ho letto su un forum inglese che è un secondario un po' "ostico", e c'è chi lo usa 1:50 o 1:200. Sto ripetendo la fluorescenza con tali concentrazioni (come suggerivi anche tu del resto).Però ho mantenuto la diluizione del primario 1:200 come nella marcatura precedente.
Spero che funzioni perchè nn mi va di chiedere un altro anticorpo :(.
P.S.: Ho ricevuto il secondario 350 già in soluzione, pronto per l'uso (0.5 mL conc 2mg/mL). Generalmente i secondari tipo 488 e 594 sono colorati, vedi cioè la soluzioncina giallo-verde e violetto (rispettivamente). Questa invece era trasparente come l'acqua. Non avendo mai usato il 350, non saprei dire se è normale o no ma mi ha colpito subito... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2011 : 18:35:22
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Dovrebbe essere un giallino molto pallido ma se hai piccoli volumi non lo noti e sembra trasparente.
Sinceramente se lo devi usare 1:50 ... beh, cambia anticorpo, non mi fiderei dei risultati a quella concentrazione.
Citazione:
Spero che funzioni perchè nn mi va di chiedere un altro anticorpo :(.
Hai la fortuna di essere in un Paese dove la ricerca è ben considerata. Ora, non dico di sperperare, ma se l'anticorpo non funziona nessuno avrà problemi a comprartene un altro! Soprattutto se l'altra opzione è quella di sprecare un sacco di materiale e tempo per far funzionare un anticorpo che non va...
Facci sapere comunque! |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2011 : 19:43:42
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Ciao Chick, anzitutto grazie ancora per la risposta. La concentrazione 1:50 l'ho vista usare in un lavoro, e la fluorescenza non era venuta così male. Per quanto riguarda il colore della soluzione, era già trasparente a 0.5 mL o almeno così mi sembrava.
Non è che nn voglio sperperare, ma odio gli sprechi e soprattutto mi seccherebbe aver sbagliato a prendere quell'anticorpo. Cmq ora vedo se riesco a migliorare lo staining cambiando concentrazione e magari anche bloccaggio (magari provo bsa invece che goat serum come faccio sempre...)
Vi terrò aggiornati!
Ancora grazie!! |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2011 : 20:49:38
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ah un'altra cosa Chick: mi interessa sapere quella cosa della diluizione in glicerolo. Usi glicerolo 100%, autoclavato? Lo aggiungi direttamente alla soluzione contenente l'anticorpo alla concentrazione iniziale (lo stock per intenderci)?
Grazie
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2011 : 21:00:28
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| Lo aggiungiamo direttamente all'anticorpo stock (e scriviamo bene sulla boccetta che è diluito 1:2!). Per il glicerolo... chiedo domani alla tecnica che se ne occupa, ma credo sia glicerolo 100%. Non penso sia autoclavato però. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2011 : 19:00:11
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aggiorno il 3d: allora il secondario ha funzionato (finalmente) a una diluizione 1:200 e 1:50. Magari in futuro posso provare 1:100, tanto per cercare di eliminare un po' di background (che cmq non è mai altissimo).
Ancora grazie a Chick80 |
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anticorpo secondario alexa fluor 350
Didattica e Relazioni
