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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
 Inserito il - 03 dicembre 2011 : 09:32:08
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Ho utilizzato il sodio bicarbonato per amplificare il segnale di una reazione che ha liberato un prodotto giallo ( il nitrofenolo).E mi è stato detto che questo sodio bicarbonato oltre a bloccare la reazione ,amplificava il segnale..ma nn capisco perchè! qualcuno mi aiuti per favore!!
Poi ho calcolato le unità totali di enzima con questa formula:
ho diviso l'OD letta allo spettrofotometro per 5 dato che la reazione è durata 5 minuti e ho ottenuto quindi l'OD per minuto che ho diviso per epsilon (4,86) e ho moltiplicato tutto per 1000.
(OD/min)/(4,86)* 1000
Inoltre nn ho capito nemmeno il senso della formula :\\ qualcuno mi aiuti 
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themian
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Ale_90
Utente Junior
296 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2011 : 10:40:27
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| Quale enzima hai usato? |
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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2011 : 10:47:01
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| beta galattosidasi |
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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2011 : 10:50:21
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Citazione:
[i] BTW che reazione era?
che significa BTW?? O.o comunque grazie per la teoria mi può essere utile..però non c'è la risposta alla mia domanda..
cmq la reazione era catalizzata dalla beta gal a cui è stato fornito come substrato l'ortonitrofenolo beta galattoside..la reazione è stata cronometrata per 5 minuti. Poi è stata letta l'assorbanza allo spettrofotometro per 3 volte..con i 3 valori di OD si è fatta la media..e l'OD media è stata divisa per 5 ( i minuti della reazione)
Per poi applicare la formula delle unità totali |
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knodel
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24 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2011 : 11:17:42
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BTW... by the way =)
cmq nel link di themian c'è scritto tutto... in sintesi (se non ho capito male quello che hai fatto in lab):
hai misurato le unità di attività enzimatica (quantita’ necessaria per convertire 1 micromole di substrato in prodotto in un minuto) della beta gal....
il principio è che l'enzima trasforma il tuo substrato in prodotto a un certa velocità (e non consideriamo l'inverso), osservando la scoparsa del primo e/o la comparsa del secondo riesci a tirare fuori le unità di attività enzimatica. Nella pratica dopo aver stoppato la reazione hai letto 3 volte il tuo campione allo spettrofotometro... per fare una media delle tre letture... (spero anche una dev standard...)
la media delle 3 l'hai divisa per 5, i minuti di reazione, ottenendo l'OD per min.... ossia il valore medio di comparsa del prodotto (per minuto)... questo perchè quando il substrato è presente ad una concentrazione molto maggiore di quella dell'enzima, assumi che questo sia sempre legato a una molecola di substrato e quindi la conversione in prodotto sia costante in relazione al tempo...fino a quando il substrato non inizia a scarseggiare... (l'ho spiegato in termini assolutamente non rigorosi....ma è per capire il succo)
nella formula che hai usato la e (epsilon) e' il coefficiente di estinzione molare... mentre 1000 credo sia il volume del saggio... (1 ml giusto?)
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knodel
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Inserito il - 03 dicembre 2011 : 11:25:37
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"la media delle 3 l'hai divisa per 5, i minuti di reazione, ottenendo l'OD per min.... ossia il valore medio di comparsa del prodotto (per minuto)..."
nel senso di tasso di conversione substrato/prodotto |
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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2011 : 12:50:41
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Citazione:
[i] mentre 1000 credo sia il volume del saggio... (1 ml giusto?)
Io in realtà mi hanno fatto moltiplicare per 10000.. ho chiesto il motivo e la risposta è stata che 10 era un fattore di diluizione della soluzione contenente l'enzima e poi si moltiplicava per 1000 per ottenere il numero intero invece che decimale. Però ora che mi ci fai pensare in realtà 1 mL è il volume totale che conteneva tutto quello che abbiamo usato per la reazione.. |
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knodel
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24 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2011 : 14:06:54
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può essere 10 (diluizione) x 1000 (vol del saggio) = 10000
così avrebbe senso credo... |
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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2011 : 15:20:28
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Citazione:
Messaggio inserito da knodel
può essere 10 (diluizione) x 1000 (vol del saggio) = 10000
così avrebbe senso credo...
si però nn ha senso il fatto che ho moltiplicato per 10000 anche in un altro caso in cui nn ho effettuato quella diluizione..bho |
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knodel
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24 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2011 : 15:48:00
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| Mmmm stesso esperimento? |
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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2011 : 16:07:40
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Citazione:
Messaggio inserito da knodel
Mmmm stesso esperimento?
si solo che le calcolavo per il controllo ,ovvero l'enzima non immobilizzato sul supporto. Perchè per il saggio con l'enzima immobilizzato io preparavo un volume di 200 um e mettevo
120 um di H20 ,
50um di substrato,
10 um di tampone,
20 um della frazione da esaminare
( che contiene l'enzima immobilizzato e essendo messa in un vol tot di 200 um ,viene diluita 10 volte..ecco perchè poi nel calcolo delle UTOT moltiplico per il fattore di diluizione) per un totale di 200 um a cui si aggiungono gli 800 um di sodio carbonato per bloccare la reazione.
Il volume del sagggio è 1 mL e deve essere 1mL anche x il controllo che contiene solo l'enzima???
in cui metto
-10 um di enzima ( che è la concentrazione di enzima usata anche prima solo che prima si divideva tra enzima legato al supporto e enzima nn legato)
-50 um di substrato
-10 um di tampone
-130 um di acqua?? ( nn ne sn sicura xk nn me lo ritrovo scritto)
Al massimo posso ricavare un fattore di diluizione di 500 ,poichè ho messo 10 um in 200 um ..xo' nn mi trovo lo stesso ..perchè si moltiplica anche qui per 10^4..uffa |
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knodel
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24 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2011 : 18:05:43
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Il volume del saggio deve essere uguale per una questione tecnica: quello che carichi nella cuvetta che metti nellomspettrofotometro deve avere un certo vol tipicamente 1ml. Ma e' semplicemente una questione legata allo strumento che sotto un certo volume nn compie la misurazione.
Se ipotizziamo che 1 ml sia il vol del saggio e 800 micro litri il vol di blocking solution..... Ti rimangono 200 micro litri di volume in cui fai la mix di reazione.
Fino a qui mi sembra tutto logico.
Ora tu hai due saggi uno cn enzima libero e l altro no... Lo scopo sara' quindi vedere la differenza tra i due. A logica io farei due mix identiche... Cambiando solo l enzima: così hai da una parte il risultato Dell enzima libero e Dell altra il risultato di quello legato.
Quindi:
120 um di H20 ,
50um di substrato,
10 um di tampone,
E il restato di enzima....
Quindi stessa diluizione .... Stessa moltiplicazione.
Mi sembra una ricostruzione Piu o meno plausibile.... Anche perché non capisco il razionale di fare un saggio con un mix di enzima immobilizzato e non....mi segui? Cioe' se ho capito bene in questo momento tu hai due dosaggi: enzima libero versus enzima libero+enzima immobilizzato.... Mi sembra un confronto un po' anomalo... Sei sicura fosse così?
Ripeto io farei libero vs immobilizzato e quindi vale il discorso della mix d cui prima.
Pero' magari a voi interessa qualcosa in particolare che in questo momento mi sfugge E quindi la mia logica va a farsi benedire :)
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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2011 : 19:20:04
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Si allora ti spiego meglio.
Io ho una soluzione in cui ho messo 10^10 spore ( prima ho detto supporto xk tanto nn stavo spiegando in dettaglio )sospese in 190 um di tampone + 10 um di enzima ( concentrazione 0,5 ug).
L'enzima era in una soluzione concentrata 0,05 ug/um perciò ne ho presi 10 um per avere 0,5 ug!
Questa è la mix di binding che faccio stare per un'ora affinchè avvenga il binding.
Da questi 200 um prelevo 70 um che saranno la mix total ( che contiene enzima legato e non legato)
I restanti 130 um li centrifugo per ottenere una frazione surnatante e una frazione pellet in cui avrò le spore ( e quindi l'enzima legato ad esse, mentre nel surnatante l'enzima libero).
Perciò ho saggiato l'attività delle tre frazioni. Ho fatto 3 mix di reazione.
In ognuna ho messo
50 um di substrato ( calcolati conoscendo ci = 0,04 M ; cf = 10 mM ; vf =200 um);
10 um di tampone pH 5,5 (calcolati sapendo che ci = 1 M ; cf = 50 mM ; vf =200 um )
20 um di campione ( per esempio li prendo la prima volta dalla frazione P , la seconda votla da S e la terza da M)
120 um di acqua per portare a volume di 200 um.
Alla fine con gli 800 um sarà 1000 um. E si trova.
Si trova anche che i 20 um sono diluiti in 200 um finale , e si ottiene ilf attore di diluizione 10.
Però qquando poi faccio il controllo ..io nn c'ero quando l'hanno fatto ..cmq suppongo che viene messa la stessa concentrazione di enzima quindi sempre 10 um
50 um di substrato
10 um di tampone
10 um di enzima
130 um di H2O??? Così arriverei a 200 ( suppongo che si debba arrivare a 200)
Spero di aver fatto capire ora..
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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
Inserito il - 04 dicembre 2011 : 11:37:46
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Mi è venuta un'idea..
poichè io ho usato la stessa formula pure per calcolare le unità totali di enzima senza spore.. penso che ho usato per forza 20 um di enzima..a concentrazione 0,5 ug/um
SPIEGO DA CAPO..
Ho saggiato l'attività dell'enzima (controllo) per esempio a 4 pH diversi. La reazione è stata fatta in triplicato quindi per ogni pH 3 mix di reazione ( in totale 12 mix di reazione)
in ognuna si mette
50 um di subtrato
10 um di tampone
20 um di enzima ( 0,5 ug di enzima)
120 um di acqua
Poichè la soluzione di enzima era 0,05 ug/ um nn posso prelevare da lì
20 um perchè altrimenti avrei più di 0,5 ug..devo perciò prelevare da una soluzione con conc 0,025 ug per um .Questo significa che devo diluire di 2 volte la soluzione madre
Faccio il cacolo di quanti microlitri totali mi servono di enzima:
20 um x12 = 240 um
QUINDI devo diluire 120 um di enzima dalla soluzione madre in 120 um di acqua.
E’ plausibile secondo voi??
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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
Inserito il - 05 dicembre 2011 : 13:21:44
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| Ho detto una sciocchezza o.O! vabbè il problema della formula e del controllo è risolto! se qlkn sa dirmi perchè il sodio carbonato amplifica il risultato della reazione..perchè ancora nn lo so ^^ grazie |
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knodel
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2011 : 00:22:58
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ahahahahhaha ti eri appuntata qualcosa male?
per il sodio mi informo.... anche se ho una mezza idea che non sia del tutto vero! |
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knodel
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2011 : 00:31:50
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o meglio....
L'OD sappresenta una concentrazione..... quindi avere un segnale amplificato vuol dire sovrastimate una concentrazione... per questo non mi sembra una cosa tanto per la quale...! |
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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
Inserito il - 08 dicembre 2011 : 10:10:50
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Citazione:
Messaggio inserito da knodel
o meglio....
L'OD sappresenta una concentrazione..... quindi avere un segnale amplificato vuol dire sovrastimate una concentrazione... per questo non mi sembra una cosa tanto per la quale...!
XD vabbè ho problemi più gravi da risolvere ! Questo cercherò di rimuoverlo! |
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sodio bicarbonato per amplificare il segnale
Didattica e Relazioni
