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chinasi84
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
 Inserito il - 01 dicembre 2011 : 15:24:16
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Ciao a tutti,
sono nuova di qui e avrei bisogno per cortesia di un vostro aiuto.
Avete mai fatto un western blot per valutare mTOR sia di base che fosforilato? o cmq proteine ad alto peso molecolare?
essendo una proteina di 289kDa ho fatto gels anche all'8% di acrilammide. Ho fatto correre i miei gels per tanto facendo uscire dal lower gel le proteine con peso molecolare più basso per avere più spazio..come risultato ho ottenuto delle corse tutte storte e la mia proteina non è cmq entrata bene nel lower gel...
sono leggermente irritata  avete qualche consiglio da darmi?
grazie mille!!
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 01 dicembre 2011 : 15:30:03
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io c ho lavorato per un anno:)
se non ricordo male, io facevo gel al 5%...infatti credo che all'8% potresti avere quelle corse storte perchè la proteina "tira" il gel...
prova così poi dimmi! :) |
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chinasi84
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 01 dicembre 2011 : 16:10:14
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Grazie mille Daria85!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 01 dicembre 2011 : 19:13:04
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Sì concordo, decisamente per quei pesi ci vuole un gel al 5%.
Prova a anche facendo migrare più lentamente il gel.
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knodel
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
Inserito il - 01 dicembre 2011 : 23:19:22
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Puoi fare un gel al 5.... E magari lo fai correre overnight
Se nn vuoi perdere le proteine più leggere....tipo la beta act se vuoi poi normalizzare...puoi pensare a un gel a diverse percentuali: riduci un po lo stacking gel (magari se puoi produrre un estratto concentrato e' meglio) e poi fai 2 o 3 running ( quello più denso in fondo). Se lo fai correre piano il risultato non e' male.
Io ci ho ho lavorato un po' .... L unica menata e' il marker ma dopo un po' c fai l occhio ( l ideale sarebbe avere un buon ab che nn t dia aspecifico.... ) |
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chinasi84
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 02 dicembre 2011 : 10:03:49
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Prima di tutto grazie a tutti per le risposte!
come primo step proverò il gel al 5% e lo faccio correre piano..
Il gel a diverse concentrazioni è interessante perchè effettivamente non posso normalizzare..quindi sono cmq fregata! 
Giusto per vedere se ho capito...nel macchinario per preparare un mini gel..tra i due vetrini "versi" i diversi lower, a partire dal più denso, uno sopra l'altro quando questi devono ancora polimerizzare..si stratificano bene? ti riesce un gel omogeneo? Scusa le domande magari banali ma mi interessa capire tutte le cose nuove che possono essere utilizzate!
Grazie ancora!
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knodel
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
Inserito il - 02 dicembre 2011 : 11:27:44
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Citazione:
Messaggio inserito da chinasi84
Prima di tutto grazie a tutti per le risposte!
come primo step proverò il gel al 5% e lo faccio correre piano..
Il gel a diverse concentrazioni è interessante perchè effettivamente non posso normalizzare..quindi sono cmq fregata!
Giusto per vedere se ho capito...nel macchinario per preparare un mini gel..tra i due vetrini "versi" i diversi lower, a partire dal più denso, uno sopra l'altro quando questi devono ancora polimerizzare..si stratificano bene? ti riesce un gel omogeneo? Scusa le domande magari banali ma mi interessa capire tutte le cose nuove che possono essere utilizzate!
Grazie ancora!
Allora prima trovi la conc del gel che t e' favorevole x vedere mTOR. Poi quando sei in pista cn quello tenti anche un wb per la proteina che usi x normalizzare..... Magari te la trovi lo stesso.
Se sei una persona sfortunata come il sottoscritto....non troverai la proteina che t serve per normalizzare e quindi passi al piano b. A questo punto puoi fare 2 cose: o fai dei test per vedere quando ti perdi la proteina x la quantificazione (magari puoi arrivare a un compromesso per cui facendo correre un tempo X salvi la tua proteina d riferimento e t ritrovi anche mTOR), oppure fai un due o 3 strati di gel...tipo al 5 e al 8. Tieni presente che sulle densità magari c devi lavorare un attimo xke le proteine più leggere che incontreranno quindi il gel più denso e' come se tirassero il freno a mano .....idem per il marker....pero' sono tutte questione risolvibili :)
Devi far polimerizzare un gel alla volta nei vetrini...per esempio prima il 5.... Poi metti l'8 e poi quando anche questo e' solido metti lo stacking..... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 02 dicembre 2011 : 12:28:14
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Citazione:
Messaggio inserito da knodel
Devi far polimerizzare un gel alla volta nei vetrini...per esempio prima il 5.... Poi metti l'8 e poi quando anche questo e' solido metti lo stacking.....
Scusa knodel ma casomai dovrà fare il contrario, in basso va il gel a % maggiore e in alto quello a % minore, altrimenti le proteine ad alto PM si impaccano comunque sopra e quelle a basso PM una volta superato il gel a pori più stretti sono libere di passare e possono anche fuori uscire dal gel.
Comunque chinasi84, inizia a vedere come va con un 5%, poi nel caso esistono anche i gel a gradiente (ma li devi acquistare già fatti a meno che tu non abbia un gradientatore). |
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chinasi84
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 02 dicembre 2011 : 14:19:56
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Grazie a tutti! vi terrò informati sui risvolti!
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knodel
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
Inserito il - 02 dicembre 2011 : 14:21:07
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Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
Citazione:
Messaggio inserito da knodel
Devi far polimerizzare un gel alla volta nei vetrini...per esempio prima il 5.... Poi metti l'8 e poi quando anche questo e' solido metti lo stacking.....
Scusa knodel ma casomai dovrà fare il contrario, in basso va il gel a % maggiore e in alto quello a % minore, altrimenti le proteine ad alto PM si impaccano comunque sopra e quelle a basso PM una volta superato il gel a pori più stretti sono libere di passare e possono anche fuori uscire dal gel.
Comunque chinasi84, inizia a vedere come va con un 5%, poi nel caso esistono anche i gel a gradiente (ma li devi acquistare già fatti a meno che tu non abbia un gradientatore).
Si si vero... Cm ho scritto nel primo post! Chiedo scusa :) |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 02 dicembre 2011 : 21:45:43
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Citazione:
Messaggio inserito da knodel
Si si vero... Cm ho scritto nel primo post! Chiedo scusa :)
Ok, no problem, basta chiarirsi! |
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chinasi84
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2011 : 11:11:44
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Allora..siccome al 5% non riesco ad ottenere mTOR (devo far per forza uscire le proteine a basso peso e il gel si sforma..insomma ho fatto un mezzo disastro..) ho aggiunto ben due variabili giusto per non complicarsi la vita...
- ho fatto un gel a più strati, sotto all'8% e sopra al 5%. mi sembra che abbiano polimerizzato bene e non ho avuto problemi..aspetto la corsa..
- ho diluito i campioni con SB con aggiunta di urea in modo da averla nei miei campioni 2M...l'ho fatto perchè mi sembra di aver capito che mTOR agisca principalmente come complesso...magari con solo SDS non riesco a separare le proteine del complesso e me le "tiro" dietro attaccate a mTOR aumentandone il peso...si lo so sto vaneggiando...sentitevi liberi di esprimere qualunque commento 
stiamo a vedere... |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2011 : 18:38:29
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mah, io l ho sempre analizzato con un semplice gel al 5%, e mettendo il laoding buffer con b-mercapto e ovviamente tris-gly-SDS...
nel gel al 5% essendo molto "lasso"la proteine a basso peso molecolare escono cmq prima! |
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knodel
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2011 : 19:09:57
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se al 5% lo vedi ma perdi quelle leggere allora ti tocca proprio il gel multistrato!!!
aspetta la corsa..... e poi vediamo!
cmq io li facevo a 3 strati per le defensine.... quindi vai tranquilla che dopo un male c'è sempre un peggio!
gli estratti da dove arrivano (animale cellule...)? sono trattati in qualche modo?
puoi pensare ad un altro marker per normalizzare nel caso... (ma dipende che estratti sono e cosa hai nel frigo del lab) |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2011 : 20:17:08
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| scusa ma quante ug carichi? hai colorato il filtro? qualche foto anche col cell? |
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chinasi84
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2011 : 11:33:53
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sono lisati totali da linee tumorali trattate con chemioterapico.
carico 50 microgrammi..il problema non credo sia legato alle condizioni di coltura..non la vedo nemmeno nel controllo..e i miei campioni dovrebbero essere buoni perchè le altre proteine vengono bene...
tra poco sviluppo la lastra e avrò il risultato..
questo gel mi fa veramente dannare..
appena riesco faccio una foto e ve la carico!
grazie! |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2011 : 12:14:33
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50ug??ma sono tantissimi!
ankio lavoravo con linee tumorali trattate, ma in wb ne caricavo 20ug!
non è ke metti troppo lisato e ti resta tutto nel pozzetto, o comunque ti intasa la corsa? |
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knodel
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2011 : 12:17:17
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cosa usi doxo, platino, 5fu...?
cmq mi sono espresso male... quello che intendevo dire è che volendo puoi scegliere un altro marker anzikè la beta act...magari più pesante evitando cosi di fare il gel multistrato.
questo però lo puoi fare solo se il trattamento nn influisce nell'espressione del marker e se hai già l'ab (spendere 300 euro non ne vale la pena)
posta la lastra! |
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chinasi84
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2011 : 13:25:16
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effettivamente al peggio non c'è mai fine...credo non ne verrò mai a capo..
la prox volta proverò a caricarne solo 20microgrammi e vedo se cambia qualcosa...ma siccome sono un caso disperato non credo..
ho sviluppato la lastra ma non è uscito nulla..è inutile postarla!però potrei farvi fare due risate! 
cmq provo a fare una GAPDH per vedere se è un problema generale o sempre del mio amico mTOR..
grazie a tutti per i consigli!vi farò sapere i risvolti! |
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knodel
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2011 : 13:56:53
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si 50 micro sono una marea.... a meno che tu non abbia un estratto super (o pozzetti grossi)... vuol dire dover caricare un volume piuttosto grosso....quindi immagino che caricherai in più riprese. 20 micro se non hai problemi particolari è una quantità più che onesta per avere dei wb positivi.
cmq quanto hai sviluppato? l'ab era nuovo o recuperato?
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chinasi84
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2011 : 16:06:44
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ho provato a sviluppare con due ecl...solo con il più forte ho ottenuto un segnale..bande aspecifiche secondo me..e di mTOR nemmeno l'ombra! anzi è venuta fuori una schifezza imbarazzante  ...tutte le bande sono deformate...come se le colonne del gel si fossero sfatte.. proprio all'inizio della corsa..appena riesco carico la foto di questa lastra..grazie!
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knodel
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2011 : 21:45:45
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.... in che senso 2 ecl?
quanti minuti hai esposto la lastra? |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 08 dicembre 2011 : 01:10:11
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| Ma non hai provato a colorare il filtro col rosso ponceau o il coomassie? almeno avrai un'idea di come è corso il gel |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 09 dicembre 2011 : 14:03:31
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Citazione:
Messaggio inserito da chinasi84
ho provato a sviluppare con due ecl...solo con il più forte ho ottenuto un segnale..bande aspecifiche secondo me..e di mTOR nemmeno l'ombra! anzi è venuta fuori una schifezza imbarazzante ...tutte le bande sono deformate...come se le colonne del gel si fossero sfatte.. proprio all'inizio della corsa..appena riesco carico la foto di questa lastra..grazie!
il fatto ke le colonne di corsa siano sfatte all'inizio avvalora la mia tesi ke c è troppa proteina.
prova 20ug risospesi in 20ul tot di LB in gel al 5%! |
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Discussione |
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western blot proteine alto peso molecolare
Didattica e Relazioni
