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Autore Discussione  

Tommasina
Nuovo Arrivato



29 Messaggi
Inserito il - 27 marzo 2012 : 11:51:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Tommasina Invia a Tommasina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti. Mi servirebbe un consiglio su come effettuare un clonaggio. La cassetta che devo clonare è grande 11000 bp. Come devo procedere? Devo usare il pGEM system 2. Ora sto individuando i primers per amplificare tutta la sequenza, ma il criterio di scelta è legato ai siti di restrizione che dovrei sfruttare per inserirlo dentro pGEM? Come si procede? Le estremità dell'amplicone devono essere poi trattate con fosfatasi alcalina per la reazione di ligation? Chi mi darebbe una mano per capire come procedere dato che non ho mai fatto un clonaggio da zero?
Grazie

roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


564 Messaggi
Inserito il - 27 marzo 2012 : 12:41:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Per inserire un frammento in pGEM non occore alcun sito di restrizione visto che si tratta di un T-vector, che sfrutta semplicemente la complementareità tra le T sporgenti del pGEM-T e le A del frammento amplificato via PCR (fa' attenzione alla polimerasi che usi, non deve avere attività proofreading). Trovi sul sito della promega un protocollo ottimo e dettagliato che chiarirà ogni tuo dubbio. A te il link http://www.promega.com/resources/protocols/technical-manuals/0/pgem-t-and-pgem-t-easy-vector-systems-protocol/

PS: davvero il tuo inserto è 11 kb???
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roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


564 Messaggi
Inserito il - 27 marzo 2012 : 13:24:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
A meno che tu non debba successivamente sub-clonare l'inserto in un altro vettore "standard". In tal caso la strategia cambia.
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Tommasina
Nuovo Arrivato



29 Messaggi
Inserito il - 27 marzo 2012 : 13:55:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Tommasina Invia a Tommasina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao Grazie!
Non avevo ancora capito questa caratteristica del pGEM T! io uso la GoTaq Hot start polimerasi (che non ha attività esonucleasica 3'>5) ma come faccio a sapere se le estremità del mio prodotto di pcr sono compatibili con le estremità sticky del plasmide?
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roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


564 Messaggi
Inserito il - 27 marzo 2012 : 14:24:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
La Taq di default aggiunge A alle estremità dell'amplicone, a meno che non abbia attività di proofreading. Essendo le estremità stocky del plasmide pGEM-T delle T, voilà la compatibilità!
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roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


564 Messaggi
Inserito il - 27 marzo 2012 : 14:25:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
*sticky
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zerhos
Utente Junior

ZERHOS

Prov.: Pisa
Città: Pisa


421 Messaggi
Inserito il - 01 aprile 2012 : 23:26:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di zerhos  Invia a zerhos un messaggio ICQ Invia a zerhos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ehm leggo che vorresti clonare 11kb di inserto dentro ad un p-GEM...........intendevi forse 1,1kb (1100bp) altrimenti dubito fortemente che tu riesca in questo clonaggio, prova a considerare altri vettori di clonaggio con differenti origini di replicazione.
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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