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w_hite
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
 Inserito il - 08 maggio 2012 : 17:52:52
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Buonasera a tutti,
tra poco comincerò come tirocinante in un laboratorio in cui dovrò testare un'eventuale attività antitumorale di complessi metallici...per cui dovrò fare il saggio MTT.
Praticamente io cosa mi aspetto di vedere? So che devo testare come controllo positivo il cisplatino,e poi chiaramente le sostanze in esame(complessi metallici) con i loro controlli(sostanza senza metallo)...per dire di avere un effetto dovrei vedere che nei controlli(senza metallo) le cellule sono vive,e nelle sostanze in esame le cellule invece tutte morte,così come nel cisplatino il cui effetto è conclamato?
Spero innanzitutto di essermi spiegata :) e poi in un vostro chiarimento...grazie!
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 08 maggio 2012 : 18:08:32
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| certo, se la sostanza ha attività antitumorale le cellule moriranno (gialle) mentre al contrario metabolizzeranno l'MTT (viola) |
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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 08 maggio 2012 : 18:14:40
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Quello che dice Daria non è proprio esatto. Dopo l'incubazione tutti i surnatanti appaiono viola, cambia però l'intensità della colorazione:
molte cellule vive= viola scuro
poche cellule vive= viola pallido |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 08 maggio 2012 : 22:12:25
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| si, ho riportato gli stremi x far capire il concetto...in ogni caso io vedevo anke pozzetti gialli\verdognoli a volte se la morte cell era abbondante. |
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biotool
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2012 : 03:52:13
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L'MTT e' un saggio di vitalita' cellulare, nel quale l'MTT (composto di colore giallo)viene processato da un enzima presente nei mitocondri, portando alla formazione di cristalli dal colore blu/viola. L'enzima e' attivo soltanto nelle cellule vive, quindi piu' il tuo complesso metallico presenta attivita' tossica nei confronti delle cellule in esame, meno intensa sara' la colorazione che andrai a quantificare allo spettrofotometro.
per il colore giallo: mettendo l'MTT nel terreno di coltura, il terreno tendera' al giallo essendo l'MTT un composto giallo, ed essendo in una concentrazione a saturazione, per evitare che sia un fattore limitante (non sono gialle le cellule che muoiono, semplicemente non hanno l'enzima attivo per convertire l'MTT e non avranno cos' i cristalli blu).
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2012 : 11:10:00
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| ovvio ke nn sono le cellule a colorarsi ma il medium :) |
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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2012 : 19:34:13
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Citazione:
Messaggio inserito da Daria85
si, ho riportato gli stremi x far capire il concetto...in ogni caso io vedevo anke pozzetti gialli\verdognoli a volte se la morte cell era abbondante.
A me non è mai capitato di vedere i pozzetti di quel colore. Ho imparato una cosa nuova, come sempre su questo forum  |
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w_hite
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
Inserito il - 12 maggio 2012 : 18:28:49
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| Grazie mille a tutti voi :) |
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w_hite
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
Inserito il - 28 maggio 2012 : 17:31:53
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Citazione:
Messaggio inserito da w_hite
Buonasera a tutti,
tra poco comincer� come tirocinante in un laboratorio in cui dovr� testare un'eventuale attivit� antitumorale di complessi metallici...per cui dovr� fare il saggio MTT.
Praticamente io cosa mi aspetto di vedere? So che devo testare come controllo positivo il cisplatino,e poi chiaramente le sostanze in esame(complessi metallici) con i loro controlli(sostanza senza metallo)...per dire di avere un effetto dovrei vedere che nei controlli(senza metallo) le cellule sono vive,e nelle sostanze in esame le cellule invece tutte morte,cos� come nel cisplatino il cui effetto � conclamato?
Spero innanzitutto di essermi spiegata :) e poi in un vostro chiarimento...grazie!
Vi riscrivo perchè ora davvero sono in pricinto di iniziare e chiaramente prima di fare il saggio MTT bisogna piastrare le cellule e fare la somministrazione delle varie sostanze...non ho capito però alcune cose avendo avuto per ora solo un'infarinatura teorica:
-la prima cosa da fare sono i calcoli per sapere quanti mg delle sostanze controllo(senza metallo) e con metallo bisogna usare in 25 microlitri di DMSO per una soluzione 100 mM?Il P.M del controllo è 582.65 g/mol quindi 1.5 mg circa; il P.M delle sostanze con metallo è 647.57 quindi 1.6 mg circa...vi trovate?
-per il cisplatino invece si deve sciogliere smepre in 25 microlitri di DMSO ma per una soluzione 25mM? Quindi sapenso che il P.M è 300.05 i mg di cisplatino sono 1.8 circa,giusto?
-ora dovrei preparare le 5 heppendorph per il controllo e per la sostanza metallica:100-50-25-12.5 e 6.25....parto dalla 100 per fare poi le diluizioni:sugli appunti ho scritto:nella 100 metto 1.2 ml di mezzo + 2.4 microlitri della sostanza che precedentemente ho sciolto nei 25 microlitri di DMSO(questi calcoli sono riferiti ad una 100 micromolare doppiamente concentrata,perchè? e come vengono fuori questi calcoli? )
-nella eppendorf 100 quindi ho questo; nelle altre(50-25-12.5 e 6.25) metto solo la metà cioènsolo 600 micorlitri di mezzo...e poi per fare le diluizioni praticamente prelevo 600 microlitri dalla 100 e li passo nella 50(in cui ho solo 600 di mezzo),da qui altri 600 che passo nella 25(in cui smepre ci sono solo i 600 microlitri di mezzo) ecc...giusto?
-per il cisplatino invece mi trovo scritto che nella eppendorf da 25 ho 1.5 ml di mezzo + 3 microlitri di cisplatino precedentemente sciolto in 25microlitri di DMSO...da dove vengono fuori questi calcoli?
-e poi sempre si procede con le diluizioni,quindi prelevo 750 microlitri di questa soluzione e li passo nella eppendorf da 12.5 in cui prima metto solo 750 microlitri di mezzo fresco...e così fino alla 1.5...
Spero in un vostro aiuto nonostante le tante domande :P |
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w_hite
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
Inserito il - 28 maggio 2012 : 18:58:57
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Scusate mi sono accorta di un errore:
per il cisplatino invece si deve sciogliere sempre in 25 microlitri di DMSO ma per una soluzione 25mM?
Ovviamente questa non era una domanda ma un'affermazione :),la domanda riguarda solo se ho fatto bene i calcoli sui mg da sciogliere in DMSO per la soluzione 25mM in questo caso... |
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drop_
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18 Messaggi |
Inserito il - 30 maggio 2012 : 10:08:38
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Ciao!
Anche se non ho molta dimistichezza su queste cose,essendo essenzialmente questioni di calcoli provo ad aiutarti:
In riferimento a questo:
-la prima cosa da fare sono i calcoli per sapere quanti mg delle sostanze controllo(senza metallo) e con metallo bisogna usare in 25 microlitri di DMSO per una soluzione 100 mM?Il P.M del controllo è 582.65 g/mol quindi 1.5 mg circa; il P.M delle sostanze con metallo è 647.57 quindi 1.6 mg circa...vi trovate?
Si praticamente ti calcoli prima le moli conoscendo Molarità(100 x 10^-3 M) che moltiplichi per 25 micorloitri,ossia 2.5 x 10^-5 L...e quindi conoscendo anche il P.M,le moli appena ottenute le moltiplichi per 582.65 e per 647.57 e ottieni proprio 1.4 ed 1.6 mg
Poi hai scritto:
-per il cisplatino invece si deve sciogliere sempre in 25 microlitri di DMSO ma per una soluzione 25mM? Quindi sapenso che il P.M è 300.05 i mg di cisplatino sono 1.8 circa,giusto?
Qui forse hai fatto i calcoli smepre per 100mM,come prima,ma dato che devi preparare una 25 mM,alla fine dovresti trovarti 0.19 mg di Cisplatino
Per quanto riguarda le diluizioni scalari ovviamente il procedimento è quello...solo che anche io non riesco a capire i 2.4 microlitri per le varie sostanze ed i 3 microlitri di Cisplatino come li hanno ottenuti...attendo su questo punto chiarimenti :) |
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w_hite
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22 Messaggi |
Inserito il - 30 maggio 2012 : 17:55:16
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Eh si grazie :)...non so che conti avevo fatto per il cisplatino ma effettivamente avevo sbagliato :)
I conti sui 2.4 microlitri ancora non li ho capiti neanche io...ho trovato appuntato solo che chiaramente se invece di una 100mM facessimo una 12.5mM,quindi fattore di diluizione 8,dovrò prelevare 19.2 microlitri dalla eppendorf in cui avevo sciolto la sostanza con il DMSO,ed aggiungerli quindi a 1.2mL di mezzo per le cellule...semplicemente 2.4 x 8...ma il problema del 2.4 di partenza resta :( |
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