| Autore |
Discussione |
|
|
miranda
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 15 maggio 2010 : 15:12:20
|
Buon giorno,
Se volessi fare una ligation tra un vetore pGEM-T Easy vector e un inserto uscito fuori da una PCR. Immagino di lavorare con un gene di 820bp. So che la concentrazione iniziale del prodotto della PCR è 14ng/microL .vorrei capire quanti microlitri devo aggiungere di questo inserto sapendo che il rapporto ottimale vettore/inserto è 1/3, e sapendo che ho aggiunto 50ng(contenuti in un microlitro)di vettore in un volume finale di 10micro litri . IO pensavo semplicemnte di fare la proporzione 1/3, ma in questo modo non considero la concentrazione iniziale del prodotto della PCR.
Non riesco a fare ordine mentale, qualcuno può aiutarmi? grazie 
|
|
|
|
|
Morfeo
Nuovo Arrivato
Città: Roma
110 Messaggi |
Inserito il - 15 maggio 2010 : 20:44:16
|
Allora tu vuoi mantenere un rapporto 1:3 vettore/inserto, quindi ragionando in termini di quantità ci metti un attimo. Dovrai prendere 50ng di vettore e 150ng di inserto (3 volte tanto), quindi preleverai dalla provetta di pcr 10,7 microlitri (così avrai 150ng) e li metterai nella eppendorf dove hai il vettore (50 ng), facendo così quello che ti cambia sono le concentrazioni perchè diluisci ma le quantità sono sempre quelle!
Se le vuoi sapere le concetrazioni saranno:
Vettore: 50 ng/1microlitro+10microliti+10,7microlitri= 2,3 ng/microlitro
Inserto: 150ng/10,7microlitri+1microlitro+10microlitri= 6,9 ng/microlitro
E come vedi la concetrazione dell'inserto è 3 volte maggiore di quella del vettore. |
 |
|
|
domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 16 maggio 2010 : 02:59:53
|
| Mah...non sono tanto convinto di questo ragionamento. Immaginiamo che 50 ng di vettore contengano 50 molecole di vettore. 50 ng di inserto (siccome l'inserto è più piccolo) saranno 300 molecole di vettore. E quindi non manterrai il rapporto di 1:3 perchè 50 ng di vettore non contengono lo stesso numero di moli di 50 ng di inserto. Dovresti calcolarti le moli di quelle due soluzioni e poi mantenere il rapporto 1:3 |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
|
|
|
Morfeo
Nuovo Arrivato
Città: Roma
110 Messaggi |
Inserito il - 16 maggio 2010 : 12:48:06
|
Se vogliamo fare le cose precise allora:
-peso medio di una coppia di basi 660 Da
-peso inserto 820bp x 660 Da= 541200 Da
-peso pGEM-T Easy vector, vedo su internet che è di 3015bp x 660Da= 1989900 Da
moli inserto= 150 x 10^-9 g / 5,4 x 10^5 g/mol = 2,7 x 10^-13 moli
2,7 x 10^-13 x 6,022 x 10^23 molecole/mole= 1,6 x 10^11 molecole di inserto ovvero 160 miliardi di molecole di inserto
moli vettore= 50 x 10^-9 g / 1,9 x 10^6 g/mol = 2,6 x 10^-14 moli
2,6 x 10^-14 moli x 6,022 x 10^23= 1,5 x 10^10 ovvero
15 miliardi di molecole di vettore
Come vedi tutto torna e la quantità di molecole di inserto è addirittura 10 volte tanto quella del vettore, quindi direi che per una ligazione va più che bene! convinto ora?
|
|
|
|
domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
|
|
Morfeo
Nuovo Arrivato
Città: Roma
110 Messaggi |
Inserito il - 16 maggio 2010 : 13:46:42
|
Vabbè comunque da qui in poi non è difficile fare il rapporto 1:3,
prendi 2,6x 10^-14 moli x 3= 7,8 x 10^-14 moli di inserto e quindi:
7,8 x 10^-14 moli x 5,4 x 10^5 g/mol= 4,2 x 10^-8 g quindi 42 ng di inserto e questo avvalora giustamente la tua ipotesi, quindi..
dato che la concentrazione nella provetta dell'inserto è 14 ng /microlitro si prenderanno 3 microlitri per avere 42 ng e si aggiungono ai 50ng di vettore, il rapporto 1:3 è così mantenuto.
|
|
|
|
domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
|
|
SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2010 : 17:32:16
|
| in genere il rapporto 3:1 che si usa nelle ligation (così come per qualsiasi altro rapporto, es 5:1 1:1)non è sul peso,ma sulla concentrazione molare. |
|
|
|
miranda
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 21 maggio 2010 : 14:09:34
|
Mamma mia quanto vi ho amato!
Grazie |
|
|
|
Morfeo
Nuovo Arrivato
Città: Roma
110 Messaggi |
Inserito il - 21 maggio 2010 : 21:11:39
|
Citazione:
Messaggio inserito da miranda
Mamma mia quanto vi ho amato!
Grazie
Ha funzionato? alla fine quanto hai messo di vettore e quanto di inserto? |
|
|
|
claire87saba
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 26 giugno 2012 : 14:39:20
|
Salve a tutti!
Anche io ho a che fare con una ligation in questo momento e ho diversi problemi!!
il mio vettore è di 4,8 kbp mentre il frammento che voglio clonare all'interno è di sole 24 bp!!! sono 2 mesi che provo e riprovo, ma niente!!
qualcuno ha qualche consiglio da darmi??? |
|
|
|
SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 26 giugno 2012 : 16:01:19
|
| 24 bp? è abbastanza difficile clonare frammenti così piccoli, ma nn impossibile. Puoi aggiungere qualche dettaglio, ad es. che tipo di clonaggio è (sticky ends, blunt etc); quali rapporti hai provato? |
 |
|
|
|
Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
|
|
roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 26 giugno 2012 : 18:20:45
|
Concordo. Magari sarebbe utile sapere qualche dettaglio in più, come dice Spemann.
Giusto una precisazione: i vettori pGEM-T permettono di effettuare clonaggi TA. In pratica hanno delle T sporgenti (si vedono dall'immagine di Martin) che vanno ad appaiarsi con le A sporgenti che normalmente si formano alle estremità di prodotti diPCR usando una polimerasi senza attività proof-reading. |
|
|
|
SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 26 giugno 2012 : 19:40:43
|
| ma claire87saba non ha parlato di vettore pgemTeasy. Non sappiamo quale vettore stia usando... |
|
|
|
|
claire87saba
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 27 giugno 2012 : 18:34:55
|
il mio vettore è un pAAV. lo taglio con due enzimi diversi (XbaI e BamHI) e ottengo sticky ends. idem per il mio frammento.. ho provato con rapporti vettore/inserto 1:20 , 1:10 1:5 1:3 e 1:1 , sia utilizzando T4 ligasi normale che fast (fermentas).. facendo anche varie prove a 22°C e a 16°c over night, ma niente!!  non so più che cosa provare! |
|
|
|
claire87saba
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
|
|
SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 27 giugno 2012 : 20:19:41
|
| posso sapere quali concentrazioni usi di vettore/inserto e in quali volumi? infine, la sequenza di 20 bp o poco + in cosa consiste? a cosa ti serve? come la ottieni? l'hai purificata da gel? hai fatto annealing di oligo che hai comprato tu? |
|
|
|
|
claire87saba
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2012 : 10:50:04
|
il frammento di 24 bp l'ho ottenuto per annealing (94°C , 5min e poi RT) di oligo ordinati (si tratta di parte di un esone), alle estremità sono state inserite le sequenze per la digestione con i due enzimi con i quali ho tagliato pure il mio plasmide. Il vettore dopo la double digest con tango buffer, tutto Fermentas, l'ho purificato e defosforilato...
Di norma utilizzo 100 ng di vettore e con il tool della fermentas http://www.fermentas.com/reviewer/app?page=Calculator&service=external&sp=Sligations calcolo la quantità di inserto che mi serve..
ieri ho provato con un rapporto 1:1 facendo due prove, con e senza BSA, ma non è cresciuto niente 
|
|
|
|
SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2012 : 11:14:46
|
Capisco. Mi pare che tu abbia proceduto bene fin qui, è difficile dire cosa sia andato storto. Hai fatto delle prove per vedere se entrambi gli enzimi digeriscono (quindi in poche parole hai visto se funzionano tutt'e due)?
Io personalmente insisterei più su dei rapporti con eccesso di inserto (3:1, 5:1 ecc). I problemi per cui il clonaggio non riesce potrebbero essere tanti: sei sicura che i due oligo si "annealino" correttamente? Hai sufficiente quantità di inserto per il clonaggio? (ho visto cmq che per un clonaggio 3:1 non ti serve molto inserto, circa 2 ng).Purifichi dopo la digestione dell'inserto?Ricalcoli la sua concentrazione? |
|
|
|
|
claire87saba
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2012 : 14:11:30
|
Prima di partire abbiamo fatto tutte le prove del caso per vedere se gli enzimi tagliano, un dubbio potrebbe essere: non è che il frammentino è troppo piccolo per far sì che entrambi gli enzimi talgino alle estremità?
ho fatto anche rapporti 1:20 e addirittura 1:40!!!
la purificazione dopo la digestione del mio inserto non la posso fare perchè faccio su colonna e dato che il frammento è molto piccolo, rischio che non si leghi al filtro! |
|
|
|
SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2012 : 14:34:05
|
infatti per la purificazione avevo la stessa paura: cioè quella di perdere tutto il frammentino. Se non fai purificazione, immagino allora che inattivi gli enzimi di restrizione a 65°C prima di fare la ligation. Il tampone di reazione è compatibile con la ligasi? Hai fatto un controllo positivo per vedere che questa ligasi funzioni?Potrebbe essere l'ATP del buffer della ligasi (via via che congeli/scongeli il buffer della ligasi, la concentrazione di ATP si riduce perchè esso si degrada man mano)?
Io personalmente avrei adottato un'altra strategia: avrei disegnato gli oligos in modo da avere delle estremità sporgenti già complementari ai siti di restrizione del plasmide (gli oligos in questo caso devono avere il 5' fosfato, modificazione che puoi aggiungere quando li ordini).In questo modo nn c'è bisogno di digerirli, purificarli ecc. Un'altra strategia potrebbe essere usare mutagenesi, per esempio Quickchange o similia.
Possono essere tanti i motivi per cui il tuo clonaggio non funzioni, mi spiace di non poterti dare una risposta diretta e precisa. |
|
|
|
|
RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2012 : 16:37:37
|
Ciao
Forse ti faccio una domanda stupida ma..hai aggiunto degli stretch di 3-4 basi a monte dei siti di restrizione negli oligo? (io in genere aggiungo tre G).. |
|
|
|
claire87saba
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2012 : 11:37:50
|
Si li ho inattivati a 65°C e cerco di avere tutte le accortezza del caso, ma sembra proprio che quel frammentino non si voglia ligare!
@RM si sono state aggiunte delle basi a monte del sito di talgio guardando sempre su Fermentas quali erano consigliate per quegli enzimi!
Secondo voi quanto è probabile che essendo così il piccolo il frammento non sia stato digerito da ambo le parti a causa dell'ingombro sterico degli enzimi???
ragazzi vi ringrazio comunque tanto per la pazienza che avete avuto nel rispondermi e cercare di aiutarmi!!  |
|
|
|
SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2012 : 12:29:34
|
Beh, sinceramente non credo che sia quello il problema, cioè dell'ingombro sterico ecc: ho tagliato spesso vettori con due siti diversi distanti tra loro poche decine di bp... Ma nelle tue piastre non hai nemmeno una colonia? o colonie che risultano negative? Scusa se mi ripeto, ma sei sicura che la ligasi funzioni? Usi la t4 neb, giusto? anche io l'ho usata ed è molto efficiente. Quanto ne usi? hai provato ad aumentare la quantità di ligasi? Un'altra domanda sciocca: visto che usi i buffer degli enzimi di restrizione per la tua ligation(visto che inattivi le endonucleasi e non purifichi, il buffer di reazione dev'essere quello degli E.R.), aggiungi ATP?
Ieri girovagando per la rete ho trovato questo sito:
http://forums.biotechniques.com/viewtopic.php?f=2&t=11516
Discutono un problema molto simile al tuo, forse puoi trovare degli spunti interessanti... |
|
|
|
|
claire87saba
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 02 luglio 2012 : 16:13:34
|
la T4 che uso è della Fermentas, non ho esperienza a sufficienza per poter dire se sia meglio o peggio della tua...
dopo il taglio con gli enzimi il vettore lo purifico perchè è di 5 kbp, è l'inserto che nn purifico... e uso il buffer della ligasi |
|
|
| |
Discussione |
|
vettore/inserto proporzioni nella ligation
Didattica e Relazioni
