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frapi
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
 Inserito il - 11 luglio 2012 : 12:40:37
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salve, sto cercando di fare l'immunofluorescenza con l'anti-alpha tubulina , su cellule germinali di pesci isolate per visualizzare i flagelli degli spermatozoi, le cellule sono fissate per 5min in glutaraldeide al 4% a temperatura ambiente, lavate in PBS 1X pH 7.4 (3X5 min), ho effettuato il blocking ( TritonX 0.3%, NGS 5%, BSA 5%)overnight a 4°C, incubato per 6h a temperatura ambiente con Anti alpha-tubulin Alexa Fluor 488 conjugate (10microgrammi/ml), lavato in PBS 1X pH 7.4 (3X5min) (tutto effettuato in camera umida).
Il problema è che riesco a visualizzare il preparato sia con il filtro per il verde che con quello per il rosso, in questo modo non riesco a capire se l'anticorpo si è legato o meno
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 11 luglio 2012 : 13:49:56
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"Filtro per il verde" o "per il rosso" non basta... bisogna vedere le specifiche esatte dei filtri. Se la proteina è abbondante (e alpha tub immagino sia abbondante) avere del bleed through di 488 nel rosso non è poi così impensabile. Dici di usare l'anticorpo a 10ug/ml, è la concentrazione consigliata sul datasheet? Prova a fare delle prove a 1ug/ml o 0.1ug/ml e vedi se il bleed through diminuisce. Vedi qualcosa con un filtro blu o far-red?
Il controllo che devi fare è fare un'IHC senza anticorpo che deve risultare completamente nera (volendo, se hai dell'alpha tubulina, puoi anche fare un controllo in cui pre-adsorbi l'anticorpo prima di metterlo sulle cellule).
Comincia a controllare che filtri hai esattamente: prendi il filtro dal microscopio e leggi sul lato del cubo cosa c'è scritto. Dirà qualcosa tipo:
BP 450-490 (eccitazione)
FT 510 (dicroico)
BP 515-565 (emissione)
Poi guarda gli spettri in un sito tipo:
https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/spektral.php
oppure
http://fr-fr.invitrogen.com/site/fr/fr/home/support/Research-Tools/Fluorescence-SpectraViewer.html
e vedi se ci sono degli overlap |
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frapi
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 11 luglio 2012 : 15:55:11
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ho fatto il controllo e il preparato emette fluorescenza e può essere visualizzato con entrambi i filtri
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 11 luglio 2012 : 18:34:52
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Beh, in quel caso hai un problema... non puoi usare un altro anticorpo con fluoroforo blu o rosso lontano? Oppure usare una rilevazione DAB?
In extremis puoi provare a rimuovere la fluorescenza endogena con del Sudan Black, ma non è sempre la migliore soluzione. |
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frapi
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 11 luglio 2012 : 19:11:15
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secondo te potrebbe questa fluorescenza potrebbe essere data dal fissativo che ho usato? non posso usare altri fluorofori perchè l'anticorpo è già coniugato
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 11 luglio 2012 : 19:18:57
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| Appunto, dicevo non hai un anticorpo non coniugato? Comunque sì, la glutaraldeide dà spesso questi problemi. Non ho mai lavorato in cellule di pesce tuttavia, quindi non so darti dritte specifiche... puoi usare PFA 4%? O magari un mix PFA/gluta (noi usiamo 2%/0.5% se non erro). |
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frapi
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 11 luglio 2012 : 19:24:05
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purtroppo ho provato anche la PFA al 4% e più o meno il risultato non cambia, pensavo di fissare in metanolo e acetone.... ti ringrazio cmq per la disponibilità :)
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