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alizzia
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
 Inserito il - 03 maggio 2012 : 18:04:45
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Ciao a tutti, avrei bisogno di qualche chiarimento sulla real time-PCR...
Sto scrivendo la tesi, e - dal momento che gli esperimenti di PCR non li ho fatti io direttamente, ma li ho visti (solo parzialmente) fare ad un'altra ragazza - mi sono venuti alcuni dubbi, soprattutto per la parte relativa ai controlli. Premetto che forse qualche termine lo sbaglierò, dal momento che la mia totale pratica di laboratorio è stata fatta all'estero, e quindi certi termini in italiano non li ho mai imparati... scusatemi!
Non mi servono spiegazioni approfondite (non è un esame, e nessuno mi chiederà la cosa in modo specifico); vorrei solo avere un'idea di quello che si è fatto in modo da poterlo riassumere in modo corretto nella tesi.
Da quello che ho capito, all'interno dei vari pozzetti della placca da inserire all'interno del termociclatore andiamo ad inserire (il tutto x 6 volte):
- tutti i campioni
- delle diluizioni di DNA standard (per la retta di taratura)
e a ciascun pozzetto aggiungiamo il fluoroforo e la Taq polimerasi, oltre ai primers per il gene da individuare (a 3 copie di ciascun campione) ed ai primers per l'actina (alle altre 3 copie di ciascun campione)
a questo punto, ottenuti i vari Ct per ciascun campione, si calcola il ratio con la formula di Pfaffl (so che c'è anche un altro metodo, ma la ragazza ha usato questo)...
E' corretto quanto ho scritto fin'ora?
E la retta di taratura quando la uso?
Grazie mille a chiunque mi risponderà...
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 maggio 2012 : 17:43:32
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Un po' difficile rispondere dato che l'esperimento è stato fatto da qualcun altro, forse la cosa migliore sarebbe farti spiegare da chi l'hai fatto.
Comunque a parte un paio di termini non corretti in Italiano che ti indico di seguito:
placca --> piastra
ratio --> rapporto
quello che hai scritto credo sia corretto, almeno se è stato fatto così, ma sembra u procedimento corretto.
La retta di taratura probabilmente è stata fatta per calcolare l'efficienza, hai bisogno di questi valori per calcolare il deltact con il metodo di Pfaffl, ma mi sembra che questo ti sia chiaro visto l'altro tuo post.
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alizzia
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
Inserito il - 05 maggio 2012 : 18:05:57
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Grazie per la correzione dei termini (se vedi qualcos'altro, fammi sapere!)
Sì sì, la retta di taratura era stata fatta proprio per calcolare l'efficienza!!! Ho riguardato meglio gli appunti ed il materiale che mi aveva fornito la ragazza che ha fatto la PCR... ed ho capito che serviva proprio a questo scopo!
Grazie comunque per le tue delucidazioni! |
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alizzia
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2012 : 19:54:24
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A mano a mano che passa il tempo, rileggendo gli appunti e quello che ho scritto, sorgono nuovi dubbi...
Ho provato a risolverli cercando nel mare magnum di internet, ma ognuno usa il proprio protocollo, che differisce anche significativamente da quello di un altro, e non riesco a venirne a capo... Credo che la cosa migliore sia proprio chiedere a qualcuno che se ne intende.
Il dubbio riguarda nuovamente l'analisi della curva di taratura. E' stata fatta mentre non ero presente, non mi è stata spiegata, nè mi è stato lasciato del materiale in proposito. Ho solo visto la preparazione delle diluizioni. Ora ho capito a cosa serve e perchè viene fatta, ma quello che non mi è chiaro è: la pendenza è quella dela curva ottenuta inserenfo sull'asse y i valori di CT e sull'asse x:
- la concentrazione di DNA standard nelle diluizioni seriali ?
- il logaritmo della concentrazione di DNA standard nelle diluizioni seriali ?
- la quantità (in ng?) di DNA standard nelle diluizioni seriali ?
- il logaritmo della quantità (in ng?) di DNA standard nelle diluizioni seriali ?
- il numero di copie di DNA standard nelle diluizioni seriali ?
- il logaritmo del numero di copie di DNA standard nelle diluizioni seriali ?
- o cos'altro ?
Le alternative che ho elencato le ho tutte trovate in paper/protocolli trovati su internet. Ma la pendenza della curva CAMBIA a seconda che si utilizzi una o l'altra unità di misura... no?!? Allora cosa si deve usare?
Altra cosa: perchè alcuni utilizzano come formula per ricavare l'efficienza:
E=10^(-1/slope)
ed altri la formula:
E=[10^(-1/slope)] - 1 ?
Io son sicura che la ragazza ha usato la prima (è una delle poche cose che mi ha lasciato). Ma da cosa dipende questa scelta? Dal metodo usato per quantificare? Nel mio caso è stato usato quello di Pfaffl:
R = Etarget^(deltaCTtarget) / Ereference^(deltaCTreference)
E' possibile che, a seconda del tipo di formula utilizzata per calcolare l'efficienza, si decida che unità di misura impiegare per l'asse x della curva di taratura?
Sempre a proposito della prima domanda: nel paper di Pfaffl, la curva di taratura ha come unità di misura dell'asse x l'indicazione "input cDNA (ng)" e la scala è di tipo logaritmico (0.025-0.05-0.1-0.25-0.5-1-etc). Quindi la definizione corretta potrebbe essere:
"la pendenza della curva di taratura, costruita inserendo sull'asse y i valori di CT e sull'asse x le concentrazioni di DNA standard nelle diluizioni seriali, utilizzando una scala logaritmica" ? Perchè a me, più che il logaritmo della concentrazione, sembra che siano state riportate delle concentrazioni su una scala logaritmica... (anche se negli ultimi anni sono stata un po' a digiuno di matematica)
Avrei voluto tagliare "la testa al toro" vedendo cosa c'è scritto nel paper di Rasmussen, che ha inventato al formula E = 10^(-1/slope)
ma in internet non c'è...
Spero che qualcuno mi possa aiutare... Grazie in anticipo! |
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picchiasebino
Nuovo Arrivato
Città: roma
52 Messaggi |
Inserito il - 10 maggio 2012 : 21:26:57
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il concetto è che con diluizioni seriali dello standard, si diluiscono progressivamente tutte le unità di misura della quantità di DNA. quindi se tu che devi decidere l'unità di misura. generalmente si usa il log del numero di copie di DNA. Naturlamente devi conoscere il rapporto tra 1C e peso molecolare (x es. "Nuclear DNA content of some important plant species" di K. Arumuganathan and E. D. Earle fornisce indicazioni x le specie vegetali). Nel caso che tu utilizzi invece degli standard a concentrazione (% peso/peso nota) come ad es. standard contenenti sequenze trangeniche 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 5% puoi usare il log delle concentrazioni. allora le curve avranno le pendenze desiderate e nelle quali puoi estrapolare il coefficiente di correlazione R2 e efficienza.
Nel tuo caso specifico sembra però che abbia usato il metodo DDCt (delta delta CT), il metodo compartaivo deo D ct tra lo standard di riferimento e il tuo target.
ti consiglio di vedere pag 17 di quaesto documento che tratta di quantificazione OGM:
http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20EN/Session10.pdf
ciao
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283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 04 luglio 2012 : 23:26:51
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Citazione:
Altra cosa: perchè alcuni utilizzano come formula per ricavare l'efficienza:
E=10^(-1/slope)
ed altri la formula:
E=[10^(-1/slope)] - 1 ?
ciao..io ho il tuo stesso dubbio..sei riuscita a risolverlo? |
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alizzia
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
Inserito il - 15 luglio 2012 : 19:06:37
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Ciao 283!
In realtà non sono riuscita a risolvere il dubbio di cui parli, nel senso che nessuno ha mai risposto a questa mia domanda.
Però credo di essermi convinta che l'utilizzo di una formula o dell'altra dipenda dal tipo di strumento che viene utilizzato. Sono riuscita a parlare con la ragazza che mi aveva fatto l'analisi; non volendo disturbarla troppo, le ho chiesto semplicemente di controllare alcune frasi e di rispiegarmi velocemente cos'era stato fatto dal punto di vista pratico (non mi sono soffermata a chiederle spiegazioni teoriche)... ma quando le ho chiesto come erano stati ricavati i valori, lei mi ha semplicemente detto che lo strumento li dava in automatico. Da qui la mia deduzione (che però, ricordo, potrebbe essere completamente sbagliata!)
Se qualche esperto volesse aggiungere dettagli in proposito... ne saremmo entrambi felici!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 15 luglio 2012 : 20:16:05
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Sono semplicemente due modi per vedere la stessa cosa, ma espressa in modo diverso.
Idealmente ad ogni ciclo di PCR si ha un raddoppiamento del prodotto, quindi io posso esprimere l'efficienza in funzione di questo, se l'efficienza è del 100% tutte le molecole di DNA si raddoppieranno e quindi avrò un valore di 2.
Questo è quello che viene calcolato con la prima formula:
E=10^(-1/slope)
che infatti restituisce valori attorno a 2.
Se il valore dello slope è 3,322 ottengo 2 che corrisponde all'efficienza del 100%.
Se però voglio esprimere l'efficienza come frequenza (o infine come percentuale) basta sottrarre 1, e questo è quello che fa la seconda formula:
E=[10^(-1/slope)] - 1
che infatti restituisce valori attorno a 1, per un valore ideale di 3,322 ottengo appunto 1.
Infine se voglio avere il mio valore espresso in percentuale non faccio altro che moltiplicare per 100 e otterrò nel caso ideale 100%.
Alla fine però sono solo modi diversi di vedere la stessa cosa, perché comunque facendo i calcoli delle quantità relative corrette con le rispettive efficienze faccio un rapporto delle due efficienze e quindi il modo in cui ho espresso l'efficienza è assolutamente indifferente. |
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alizzia
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
Inserito il - 16 luglio 2012 : 19:28:42
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Grazie GFPina,
sempre chiara e gentilissima!!! |
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283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 17 luglio 2012 : 15:34:15
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| grazie mille per le risposte!!! |
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