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soumabio
Nuovo Arrivato



78 Messaggi
Inserito il - 25 settembre 2015 : 12:06:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di soumabio Invia a soumabio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti ,

devo fare una reazione di digestion ad un plasmide con l'enzima Sall , ma prima dovrei fare una dilution al mio plasmide stock chi è concentrato (1.9082 ug)e che devo portarlo ad una concentrazione di 0.5ug e poi determinare il volume da prelevare per una reazione di digestion ad un volume finale di 25 ul .

il calcolo che ho fatto è :

0.5ug ci sta circa 3.8 volte in 1.9082 ug e quindi dovrei fare una dilution approssimata di 1:4 .

la mia domanda è qualche volume prelevare dalla dilution per la reazione , avendo i volumi necessari del buffer (2.5 ul) e dell'enzima (0.5 ul)e poi il resto 22 ul da cui devo estrarre il volume del mio campione ?? devo solo approssimare o c'e qualche calcolo preciso che devo fare ??'

Vi ringrazio anticipatamente

Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1043 Messaggi
Inserito il - 25 settembre 2015 : 22:27:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Dipende da quanto DNA vuoi tagliare! Considera che solitamente si dice che una unità di enzima è quella quantità di enzima che taglia 1 ug di DNA in 1 ora (con tutte le dovute note del caso).

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soumabio
Nuovo Arrivato



78 Messaggi
Inserito il - 26 settembre 2015 : 12:26:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di soumabio Invia a soumabio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
il DNA che devo tagliate è 0.5 ug/ul quindi devo prelevare 0.5 ul di esso per la mia reazione (25 ul) ??

la mix seguente può andar bene :???

ddH2O : 21.5 ul
10X NEBbuffer 3.1 : 2.5 ul
Sall-HF : 0.5 ul
Plasmid 189 (0.5ug) :0.5 ul
Total : 25 ul

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Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1043 Messaggi
Inserito il - 26 settembre 2015 : 13:35:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scritto da MolecularLab Mobile

Ma a cosa ti serve questa reazione? Clonaggio o semplicemente è una digestione analitica per vedere il pattern di taglio sul tuo plasmide?

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soumabio
Nuovo Arrivato



78 Messaggi
Inserito il - 26 settembre 2015 : 19:22:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di soumabio Invia a soumabio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
la reazione mi serve per verificare che il mio plasmide (già costituito dall'assembly di un insert e un linearize plasmide) è quello giusto , quindi è un specie di controllo prima di proseguire con la sua microinjection in C.elegans .
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Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1043 Messaggi
Inserito il - 26 settembre 2015 : 20:19:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scritto da MolecularLab Mobile

Allora la quantitá di plasmide da usare in reazione la scegli tu, deve essere sufficiente da poter visualizzare su gel ogni banda che ti aspetti di ottenere dalla digestione (quindi direi non meno di 100 ng per banda). Se il plasmide deve solo linearizzare 0.5 ug di DNA sono più che sufficienti..anzi sono quasi troppi se poi intendi caricare l'intera reazione nel gel.

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