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Nick_row
Utente Junior
361 Messaggi |
 Inserito il - 18 dicembre 2007 : 13:37:01
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mi serve una mano...ho già cercato su vari siti,compreso questo forum,ma non riesco ancora a chiarirmi le idee...qualcuno saprebbe spiegarmi la tecnica dell' MLPA,senza rimandarmi a link inglesi o poco comprensibili...fate conto che mi serve solo un'idea chiara,visto che stò preparando l'esame di "diagnostica biotecnologica"...grazie mille a tutti!
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Nick_row
Utente Junior
361 Messaggi |
 Inserito il - 18 dicembre 2007 : 20:46:24
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dai ragazzi,mi serve davvero una mano  ...up up!!! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 19 dicembre 2007 : 05:24:30
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MLPA = Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
Innanzitutto converrebbe leggere il paper originale (in inglese...) dove spiegano il tutto con tanto di figure, schemi ed esempi! 
Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification.
Comunque l'idea è la seguente:
Vuoi analizzare determinate mutazioni o delezioni etc., nei geni A, B, C e D (puoi averne quanti ne vuoi ovviamente). La MLPA ti dà la possibilità di analizzarle tutte insieme usando una sola coppia di primers.
Devi innanzitutto preparare delle probes per ciascuno dei tuoi geni, costruite da due parti.
La prima parte è un piccolo oligo sintetico, con una sequenza complementare ad uno dei primers ed una sequenza "stuffer" (cioè di riempimento) di ~20bp complementare al tuo gene di interesse
---P1---SSSSS
La seconda parte è un oligo più lungo, contenente il resto della sequenza stuffer (25-40bp) che vuoi identificare e la sequenza complementare all'altro primer, il tutto clonato in un vettore di fago M13.
SSSSSS---P2---
A questo punto mischi le tue probes con il DNA e avrai l'attacco delle varie probes alle varie sequenze, ad es:
P1 ---P2 P1 ---P2 P1 ---P2
\ / \ / \ /
aaaaaa aaaaaaa bbbbb bbbbbb ccccccc ccccccc
----AAAAAAAAAAAAAA-------------------------BBBBBBBBBBBB----------------CCCCCCCCCCCCCCC------
A questo punto usi la ligasi per connettere le due parti di ciascuna probe:
P1 ---P2 P1 ---P2 P1 ---P2
\ / \ / \ /
aaaaaaaaaaaaaa bbbbbbbbbbbb ccccccccccccccc
----AAAAAAAAAAAAAA-------------------------BBBBBBBBBBBB----------------CCCCCCCCCCCCCCC------
E puoi quindi fare una PCR con i primers complementari a P1 e P2 e amplificherai in una sola volta tutti i geni di interesse (che ti daranno prodotti distinguibili x la diversa lunghezza)!
Ovviamente se ad es. non hai il gene A, i due frammenti di probe non verranno ligati e quindi non avrai amplificato dalla PCR.
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Nick_row
Utente Junior
361 Messaggi |
Inserito il - 19 dicembre 2007 : 10:08:19
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 ...mmmmh...più o meno ho capito dai!!!ti ringrazio! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Nick_row
Utente Junior
361 Messaggi |
Inserito il - 19 dicembre 2007 : 14:23:48
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| ma si dai,un pò con la tua spiegazione,un pò con l'articolo,dovrei aver capito la cosa...grazie mille!se ti ponessi la domanda:potenzialità,difetti e scopi principali dell'mlpa,cosa risponderesti?grazie ancora! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 19 dicembre 2007 : 22:55:25
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Direi che ha come vantaggio il fatto di poter rilevare molti geni con un solo set di primers e una sola PCR. E' utile per vedere delezioni/inserzioni e anche numero di copie alleliche.
Così su due piedi non vedo grossi svantaggi, ma non l'ho mai fatta quindi magari c'è qualcosa che mi sfugge.... :P |
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Nick_row
Utente Junior
361 Messaggi |
Inserito il - 21 dicembre 2007 : 23:40:09
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grazie mille...l'idea che mi sono fatto dovrebbe bastare! |
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aitan3
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
71 Messaggi |
Inserito il - 22 dicembre 2007 : 12:49:40
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complimenti per la spiegazione chick.
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Biotech_is_PNA
Utente Junior
Città: Parma
123 Messaggi |
Inserito il - 10 agosto 2008 : 19:40:06
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GRAZIE!!!! |
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germy
Nuovo Arrivato
74 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2009 : 19:15:16
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| ..ma il vantaggio di utilizzare una sola coppia di primers credo che sia a livello economico un risparmio che nn è controbilanciato dall'utilizzo di queste particolari sonde che tra l'altro dovrebbero essere diverse per ogni gene stiamo considerando...in un caso di questo tipo basterebbe una bella multiplex.... |
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dekiasartahias
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2015 : 11:43:00
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| Buongiorno, vorrei avere un chiarimento riguardo un passaggio di questa tecnica: mi chiedevo se la frase di chick80 "La MLPA ti dà la possibilità di analizzarle tutte insieme usando una sola coppia di primers" fosse riferita solo all'uso dei primer o in generale alle sonde utilizzate. Mi spiego meglio: per ottenere la quantificazione tramite elettroforesi capillare (come nella figura 7 del link citato) sono stati utilizzate tante coppie di sonde quanti geni si volessero analizzare, giusto? |
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