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xika987
Nuovo Arrivato
Città: Napoli
4 Messaggi |
 Inserito il - 18 dicembre 2015 : 11:56:08
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Salve a tutti, non so se questa sia la sezione adeguata per questo problema ma sono disperata e ci provo.
Sto cercando di clonare 11 geni, 3 dei quali non gc rich e 8 gc rich.
Ho amplificato con successo questi 11 geni, e sto utilizzando un sistema di clonaggio pettopo 100.
Ho seguito ogni fase del protocollo,utilizzando pcr "fresche" e ho purificato da gel le bande per evitare aspecifici. In nessun caso,tranne che in uno gc rich ho ottenuto la positività delle colonie (ho testato un gene non gc rich e 4 gc rich) ovvero,ho ottenuto cloni su piastra solo nell'unico gene non gc rich.
Posto che il problema sia questo, ho fatto varie colony per screenare i campioni e ho ottenuto il mio inserto. Poi ho fatto delle miniprep su inoculi fatti dalla piastra e ho rifatto la pcr; ho riottenuto l'amplificato. Però ho provato a tagliare con diversi enzimi di restrizione (a coppie o in singolo, a singolo e a doppio taglio ecc) ma dalle dimensioni è come se l'inserto non fosse presente. Ho ripetuto lo stesso procedimento con altre colonie, ho rifatto la procedura con lo stesso iter ma il risultato è sempre lo stesso. Ora, prima di sequenziare i campioni,secondo voi è possibile provare qualche altra strada? Grazie mille!
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là
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 18 dicembre 2015 : 16:25:21
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| Interessante, anche io facendo pcr da colonia vedo l'inserto che mi interessa dopo il clonaggio ma quando faccio le digestioni di prova non vedo l'inserto e il vettore sembra vuoto... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 18 dicembre 2015 : 17:52:57
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Boh, mai successo!
Comunque provo a spararne qualcuna...
non è possibile che si generino più frammenti della stessa lunghezza, e quindi le bande co-migrano?
Il sistema di clonaggio è direzionale o no? Il frammento può essere inserito in senso inverso?
Magari si forma un nuovo sito di restrizione.
Ma per la colony PCR che primers utilizzi, dove sono localizzati? |
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xika987
Nuovo Arrivato
Città: Napoli
4 Messaggi |
Inserito il - 18 dicembre 2015 : 21:27:54
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| Grazie per le risposte!Il sistema è direzionale e i primers coprono tutta la sequenza,dall'atg allo stop(se è questo quello che intendi per localizzazione) per il resto non saprei..penso per lo più che risolveremo con il sequenziamento a questo punto...ormai le ho provate tutte! |
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