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Ari23
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 10 febbraio 2020 : 08:40:59
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Ciao a tutti,
sto studiando biologia molecolare e non riesco a capire quando è da preferire l'uso di vettori di clonaggio e quando la PCR.
Grazie mille,
Arianna
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 11 febbraio 2020 : 20:22:07
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L'uno non è da preferire all'altro. Servono entrambi per il clonaggio.
La PCR amplifica una porzione di DNA, ma finisce lì la sua funzione. Questo frammento di DNA è abbastanza instabile (ha le estremità libere) e non può essere facilmente "introdotto" in una cellula e non ha alcuna funzione (non ci sono siti di trascrizione per esempio)
Se viene però clonato in un vettore diventa più stabile, può essere usato facilmente per trasformare/trasfettare cellule, è economico amplificarlo e si possono aggiungere funzioni (siti di trascrizione/polyA).
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Ari23
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2020 : 07:59:43
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Grazie mille.
Ma ora ho un altro dubbio.
Nel caso in cui volessi costruirmi una sonda completa che ricopra tutta la sequenza di cDNA di un gene (per andare a identificare tramite Northern-Blot tutti i diversi trascritti) mi conviene utilizzare vettori di clonaggio? In questo caso la PCR non sarebbe una buona scelta vista la lunghezza della sequenza da amplificare giusto?
Citazione:
Messaggio inserito da domi84
L'uno non è da preferire all'altro. Servono entrambi per il clonaggio.
La PCR amplifica una porzione di DNA, ma finisce lì la sua funzione. Questo frammento di DNA è abbastanza instabile (ha le estremità libere) e non può essere facilmente "introdotto" in una cellula e non ha alcuna funzione (non ci sono siti di trascrizione per esempio)
Se viene però clonato in un vettore diventa più stabile, può essere usato facilmente per trasformare/trasfettare cellule, è economico amplificarlo e si possono aggiungere funzioni (siti di trascrizione/polyA).
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2020 : 19:42:25
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Northern Blot...qualcuno li fa ancora???
Non sono giovanissimo, ma non ne ho mai fatto uno e sinceramente non credo si facciano più (e c'è un motivo)
Citazione:
una sonda completa che ricopra tutta la sequenza di cDNA di un gene (per andare a identificare tramite Northern-Blot tutti i diversi trascritti)
Non credo funzioni (se ricordo bene come funziona)...Questa sonda sarebbe in grado di legarsi al gene completo, ma non alle isoforme mancanti di qualche esone a causa di un non completo appaiamento...no?
Citazione:
In questo caso la PCR non sarebbe una buona scelta vista la lunghezza della sequenza da amplificare giusto?
Dipende da quanto è lungo il gene e quanto sono lunghe le isoforme.
Se il gene è lungo 2000bp, e ha 2 altre isoforme da 1500bp e 1000bp io andrei di PCR e vedrei le isoforme su gel di agarosio.
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