lastre WB in negativo

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pippilita
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6 Messaggi

Inserito il - 30 giugno 2007 : 14:24:55

sto eseguendo dei Western Blot utilizzando ab anti MDA in rabbit.purtroppo le lastre si sviluppano in negativo, marker compreso...qualcuno sa dirmi perch�?

P.S. ho gi� provato tutte le diluizioni possibili sia del 1'ab che del 2'..
grazie in anticipo..

biomol
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65 Messaggi

Inserito il - 01 luglio 2007 : 21:09:10

ciao,
� successo anche a me e anzitutto devi sapere se il tuo anticorpo primario � monoclonale o policlonale....poi prova ad aumentare il latte nel bloking e se non funzione aggiungi oltre al latte (se gi� lo fai)anche la bsa nella diluizione dell'anticorpo primario...questo � quello che posso dirti..
in bocca al lupo!

plof
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13 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2007 : 10:58:24

Citazione:
Messaggio inserito da biomol

......poi prova ad aumentare il latte nel bloking e se non funzione aggiungi oltre al latte (se gi� lo fai)anche la bsa nella diluizione dell'anticorpo primario...

L'aspetto e' negativo perche' sono le proteine trasferite che fanbno da blocking e appaiono come bande negative sul background. Un effetto di questo tipo puo' capitare, oltre che quando il blocking e' insufficiente, quando si usa siero con emolisi e rivelazione con immunoperossidasi.

pippilita
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6 Messaggi

Inserito il - 03 luglio 2007 : 19:40:20

l'anticorpo � policlonale, nella sua diluizione c'� bsa1% e NaN3 0.1%. il bloccaggio � stato fatto in latte 5% sia per 1h e mezza che over night. con poca differenza. ho anche provato il bloccaggio con una soluzione di BSA1%.
ho provato anche ad omettere il 1' ab per essere sicura che il background non fosse dovuto al legame aspecifico del 2'ab: la lastra non si � impressionata.
la rivelazione � stata fatta con ecl.
non so....grazie cmq per le opinioni!

smile105
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Citt�: Napoli

29 Messaggi

Inserito il - 07 luglio 2007 : 23:47:47

Generalmente succede quando c'� un eccesso di campione caricato...fidati,� capitato pure a me!prova a caricare di meno!