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kiki
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
 Inserito il - 23 settembre 2007 : 18:51:08
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Ciao a tutti !ho ancora bisogno del vostro aiuto x un dubbio che mi è venuto:
Ma perchè dopo l'estrazione di DNA, il DNA deve essere conservato in frigorifero a 4 gradi x una notte prima di poterlo controllare?io uso l'High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche) per l'estrazione e l'ultimo passaggio è l'eluizione del DNA dal filtrino con l'elution
Perchè L'elution buffer prima di usarlo va preriscaldato a 70 gradi?altrim nn funziona?
Ultima cosa, in genere quando in lab si fanno sequenze la PCR x sequenza si fa in un volume di 50 microlitri, poi da qui segue purificaz con microcon, big dye e purificaz con centrisept
Ma perchè la PCR x seq si fa in 50 microlitri e nn in 25 microl? x avere una determinata concentraz di dna?
Grazie infinite ancora una volta!!
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gianpierolandolfi
Nuovo Arrivato
84 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2007 : 20:29:58
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l'unica cosa che ti so dire delle tre domande...
il dna dopo averlo estratto lo analizzavo subito. consderando che viene tenuto a 4 gradi per conservarlo. perciò per me potrati analizarlo subito..
io facevo così
per il resto non uso quel kit io estraggo il dna con il vecchio metodo
sai fenolo, cloroformio.... ecc |
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Gabriele
Utente
Prov.: Pisa
Città: Pisa
615 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2007 : 23:44:51
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| Anche io lo leggo subito. |
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe." |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2007 : 00:03:15
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Mi sembrava (ma non ne sono sicurissimo) che il passaggio in frigo o/n o un'oretta nel -80 faciliti la precipitazione del DNA.
Non saprei dire bene perchè e come però... |
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2007 : 09:25:25
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da me estraiamo il dna con il salting out senza fenolo, il passaggio di reidratazione del dna dopo la raccolta del fiocco dall'etanolo lo facciamo o/n a 37°C in agitazione per cui non so proprio darti una spiegazione...
Citazione:
Perchè L'elution buffer prima di usarlo va preriscaldato a 70 gradi?altrim nn funziona?
nei kit di estrazione riscaldare l'eluition buffer (o l'acqua, di solito funzionano comunque!) serve ad aumentare l'efficienza della purificazione...il buffer riesce meglio a scalzare il dna dalla membrana...ma nonfunziona nonfunziona per esperienza personale o chi ti ha insegnato ad usare il kit ti ha detto che non funziona?
Citazione:
Ultima cosa, in genere quando in lab si fanno sequenze la PCR x sequenza si fa in un volume di 50 microlitri, poi da qui segue purificaz con microcon, big dye e purificaz con centrisept
scusa non ho capito...tu fai una pcr di amplificazione in 50ul che poi visualizzi in agarosio, purifichi e usi per la reazione di sequenza con il big dye?
se quello che ho capito è esatto l'unica logica per questa cosa è avere più materiale per la reazione di sequenza...noi facciamo tutte le pcr in 25ul, ne purifichiamo 20 (5ul vengono caricati su gel) che vengono generalmente eluiti in un volume maggiore (30/40ul)...probabilmente dipende dalle colonnine che usate per la purificazione, prova a leggerti il datasheet...può anche essere che nessuno si sia mai preso la briga di vedere se funziona anche in 25...
Chica |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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powergirl
Nuovo Arrivato
Città: potenza
35 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2007 : 10:20:29
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| ciao! io ricordo che il DNA si tiene una notte a +4°C per fare in modo che si solubilizzi completamente nel buffer in cui lo risospendi. Io usavo T.E. o acqua ma non conosco il kit e il buffer che usi tu. Il problema che potresti avere nel momento in cui il DNA è tanto e non è ben risospeso è di avere ovviamente una quantizzazione sbagliata! Però anche io spesso ho usato subito il DNA! |
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2007 : 11:13:16
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Se leggi bene il protocollo ti dice:
You may:
1 EITHER use an aliquot of the eluted nucleic acids directly in standard or long template PCR.
2 OR store the eluted nucleic acids at 2 to 8°C for later analysis.
Quindi semplicemente se non lo usi subito puoi conservarlo in frigo
Ciao
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kiki
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2007 : 15:34:49
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Grazie mille a tutti! per quanto riguarda le pcr x sequenza biochica si in pratica io faccio la pcr in 50 microl, 5 li carico in gel per vedere se è venuta, gli altri 45 li purifico con il kit microcon,alla fine ottengo 20microl di prodotto purificato
Avrei un'altra domanda da porvi secondo voi per quanto riguarda la "rilevazione dei polimorfismi" quali vantaggi presentano le curve di melting(fatte per esempio con light cycler)rispetto alla dhplc?con la dhplc riesco a rilevare anche gli omozigoti per il polimorfismo?
Seconda cosa:qualcuno di voi usa o ha usato Takara Ex Taq? sapete quali differenze presenta rispetto a Taq Gold?
Grazie ancora!!! |
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DNA estrazione
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