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lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
 Inserito il - 10 ottobre 2007 : 08:36:11
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ciao ragazzi volevo chiedervi una cosa...devo mettere 2 x 10^5 cellule in un pozzetto di 24 well quanti microlitri devo mettere? siccome sono cellule prelevate cn una spazzolina dal naso nn è semplice contarle cm ad es le 3t3 così oltre al calcolo mi chiedevo se voi lo sapevate perchè io ne ho messi in un pozzetto 500 ul (il max che ci sta nelle 24 well essendo piccole) e in uno 300 ul ma purtroppo sono tante cellule ammassate e nn aderiscono se nn solo un 20% grazie elisa
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Giuliano652
Moderatore
Prov.: Brescia
6941 Messaggi |
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lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
Inserito il - 10 ottobre 2007 : 21:12:17
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2 x 10^5 ho questo dato...quanti microlitri devo mettere? grazie  |
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Luca-DNA
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
68 Messaggi |
Inserito il - 10 ottobre 2007 : 21:20:54
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| ma se non conti le cellule e quindi non sai la concentrazione delle tue cellule come fai a piastrarne il numero desiderato??? |
A scientific man ought to have no wishes, no affections, - a mere heart of stone. (C. Darwin) |
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Giuliano652
Moderatore
Prov.: Brescia
6941 Messaggi |
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lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
Inserito il - 11 ottobre 2007 : 10:51:49
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| nella falcon ho 2.4 ml ke proporzione devo fare x avere poi 2x10^5 cellule da mettere in un pozzetto contenente 300 ul di terreno? grazie |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 11 ottobre 2007 : 11:23:07
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Non ti interessa sapere quanta soluzione di partenza hai (in ml)!
Devi pensare:
1)cosa voglio sapere?
Vuoi sapere quanti ul di coltura prelevare per raggiungere un certo numero di cellule
2)E cosa significa?
Significa che hai una coltura in cui ci sono delle cellule (un certo numero) immerse in un liquido. Tu vuoi sapere quanto liquido prendere per prelevare 2x10^5 cellule.
3)E cosa mi serve per trovare una risposta?
Ovviamente ti serve sapere quante cellule ci sono in un ml della coltura di partenza.
Pensa che la coltura sia un sacco di fagioli e che i millilitri siano manciate!
La tua domanda allora sarebbe: voglio prendere 100 fagioli da un sacco alto 1 metro e mezzo. Quante manciate devo prendere? Bhe chi lo sa, dipende da quanti fagioli prendi con una manciata!
Spero di non averti incasinata di piu'!
Ma non aspettarti una risposta pronta, cerca di capire il procedimento perche calcoli del genere servono 1000 volte al giorno!
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gianpierolandolfi
Nuovo Arrivato
84 Messaggi |
Inserito il - 11 ottobre 2007 : 13:12:40
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ciao,
oltre a quello che ti ha detto valia io aggiungerei questo....
ha i prelevato delle cellule, io le centrifugherei (facevo 8 minuti a 1000 rpm) la soluzione di partenza con le cellule dentro in modo da ottenere un surnatante che butterei via e un pellet.
per il surnatante, non so che tipo di cellule hai, però dico butterei perché mi capitava di dover centrifugare a 1200 rpm per 10 min per pellettare davvero tutto. perciò controlla (con camere burker)
ottenuto il pellet, risospendi prima in un ml di rpmi, se sono troppo ammassate mettine un pò di più, ad esempio io le mettevo in 6 ml ma per te protrebbero essere troppo diluite. qua purtroppo ti devi regolare tu perché dipende ovviamente da quante cellule hai e da quanto parti,
poi certo dipende se sono piccole o grandi.....perciò se in un dato volume beh ce ne sono di più o di meno..
anche qui ti devi regolare, ma basta sol una volta che lo capisci
importante:
1)ti ho detto rpmi perché parto dal presupposto presupposto che
le cellule crescano in rpmi o l'esperimento venga fatto utilizzando in rmpi. se non è così beh fa gli opporuni aggiustamenti. o che ne so in caso vadano in terreni differenti che devono mancare di componenti presenti in rpmi lava con pbs 2 volte.
2)per i prossimi calcoli terrò conto di un volume totale di rpmi in cui hai risospedo le cellule di 6 ml, sennò vai in confusione e pure io....
quindi mescoli bene, pipetti 3 o 4 volta con la pippetta e raccogli una goccia in una eppendorf che etichetti bene. quindi con quella eppendorf vai vicino al microscopio. quindi mescoli su una supoerficie pulita, che ne so il coperchio di una scatola di puntali lavato con alcool, e metti 10 microlitri di tripan blu e 10 di sospensione cellulare.
anche in questo caso beh devi mescolare bene prima di prendere i 10 micrilitri dalla sospesione cellulare della eppendorf
quindi mescoli il tripan con le cellule. e metti nella camera burker....
ora conti le cellule, ad esempio in 5 quadranti, e poi dividi il numero ottenuto per il numero di pozzetti (fai la media) e moltiplici per 10.000 e ottieni il numero di cells per ml.
che ne so hai contato 400 cells in 5 avrai per ml: 400/5 * 10^4 = 800.000 cells per ml
per sapere in totale: devi moltiplicare il valore per ml per gli ml totali dove son stati risposese le tue cells.
nel caso precedente se le avevi rispese in 1 ml ovviamente non cambia niente, se le avevi risospese in 6, devi moltiplicare per 6.
ovviamente devi tenere conto di anche di una altra cosa che forse avrei dovuto dirti prima: fattore di diluizione.
nel nostro caso si è diluito uno a due, infatti abbiamo preso dalla eppendorf 10 microlitri e li abbiamo mescolati con 10 di tripan, perciò devi motiplicare per due il valore 800.000 ottenuto = 1.600.000
ora partendo dal fatto che hai 1.600.000 cells/ml o 9.600.000 (totali in 6 ml) e devi mettere 200.000 cells per pozzetto sapendo di voler mettere per ogni pozzetto 500 microlitri.
io ragionerei in base al numero totale di cellule da mettere in tutti i pozzetti, così è più semplice.
ovvero devi mettere 200.000 cells per pozzetto e i pozzetti che devi utilizzare in totale sono che ne so 24 (anche in questo caso ti do un valore preciso di pozzetti. in totale ti servono 200.000 cells * 24 = 4.800.000 cells.
tu nei tuoi 6 ml hai 9.600.000 di cells. quanti ml di rpmi devi prendere per prendere? 9.600.000 cells: 6 ml = 4.800.000 cells : X ml (volume da prelevare)
X = 4.800.000 cells * 6 ml / 9.600.000 cells = 3 ml
mescoli bene con la pippetta e prelevi 3 ml e li metti in una altra falcon.
a questo punto quanto terreno ti serve??
tu hai la concentrazione giusta ma hai il volme giusto?
il volume totale di terreno che ti serve è 500 microlitri per 24 pozzetti = 0.5 ml * 24 = 12 ml
quindi devi aggiungere altri 9 ml e mescolare bene. e sei pronta per mettere 200.000 cells per pozzetto con 500 ul diterreno.
quindi come vedi devi contarle le cellule sennò come fai????
ciao e dimmi se sono stato chiaro, spero di si
a ditemi se ci sono errori, insomma non voglio dare consigli sbagliati :)
ciao :)
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gianpierolandolfi
Nuovo Arrivato
84 Messaggi |
Inserito il - 11 ottobre 2007 : 13:20:41
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una altra cosa che mi sono accorto di averti detto in modo poco chiaro:
devi fare la media delle cellule che hai contato in base ai quadranti della camera burker....
ovvero 400 cells in 5 quadranti, ok??
quindi nel caso precedente devi fare ne seguente modo:
400/5 * 10^4 * 6 * 2
400/5 = la media cell per pozzetto
10^4: il volume complessivodi ciascun quadrante e di 10^-4 perciò moltiplicando per 10^4 ottieni il numero di cells per ml.
6: volume totale di terreno in cui hai rispeso le cellule, che ovviamente è variabile...
2: fattore di diluizione, nel nostro caso uno a due perché hai messo 10 ul di sospensione cellulare con 10 di tripan blu.
ovviamente ti ho dato vlaori pracisi per aiutarti e capire ma devi tenere conto che per te protrebbe non essere necessario usare il tripan, perciò
niente diluizione o che invece di 6 ml me usi 3 e varia il volume totale
come potresti avere meno cellule per pozzetto o potresti contare un numero diverso di pozzetti .. insomma dipende. |
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gianpierolandolfi
Nuovo Arrivato
84 Messaggi |
Inserito il - 11 ottobre 2007 : 13:24:06
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ah quando dici:
"così oltre al calcolo mi chiedevo se voi lo sapevate perchè io ne ho messi in un pozzetto 500 ul (il max che ci sta nelle 24 well essendo piccole) e in uno 300 ul ma purtroppo sono tante cellule ammassate e nn aderiscono se nn solo un 20% grazie elisa"
non ho capito bene, ma credo tu intendessi che che in un pozzetto sono più ammassati in altri meno.
beh questi si risolve solo quando risospendi bene, infatti ti ho ripetutto in maniera credo logorroica d irisposendere bene :)
ora ho davvero finito. |
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Giuliano652
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Iside
Utente Attivo
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Inserito il - 11 ottobre 2007 : 18:01:23
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Citazione:
Messaggio inserito da Giuliano652
tra parentesi... sono quasi convinto che in una piastra da 24 ogni singolo pozzetto contenga due ml massimo, non 500 ul... controllo.
forse 2 ml in ogni pozzetto di una piastra da 24 sono tantini...io metto 2 ml/pozzetto nelle piastre da 6 |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Giuliano652
Moderatore
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lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2007 : 09:27:42
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| nelle 24 well metto max 500 ul però o sono troppe cellule o nn ci sono inoltre se le filtro con lo cell strainer da 40 o 70 um alle volte nn c'è niente. Il problemi è che queste cellule nn aderiscono e muoiono che matrice posso usare? il collagene nn funziona... |
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piastrare cellule
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