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giorgio75
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 26 ottobre 2007 : 03:51:12
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Ho dei ampioni di estratto proteico di ipotalamo. L'estrazione e' stata fatta con NP40. Il mio problema e' che non riesco a normalizzare la quantita' di proteina da caricare nei pozzetti. Sto usando un anticorpo contro b-actina.
Per la detezione sto utilizzando un anticorpo HRP-coniugato e l'ECL e' della Pierce (SuperSignal West Pico Chemiluminescente Substrate cat 34080).
La prima prova l'ho fatta caricando 10 ug di proteina totale per pozzetto... nella camera buia si vedevano le bande fluorescenti ad occhio nudo!..ovviamente il film di sviluppo anche tenendolo per quanche secondo rimaneva sovraesposto.
Ho visto poi che l'ECL che uso e' troppo sensibile e vanno usate minori quantit' di proteina e anticorpi.
Caricando 1 ug di proteina tolale per pozzetto ed usando concentrazioni dimezzate di ab secondario poi ho potuto invece avere un segnale piu' normale.
Comunque bastano piccolissime differenze di proteina per dare segnali completamente diversi. E' possibile che la quantita' di proteina che carico sia troppo bassa??
Aspetto qualche suggerimento.Ciao
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 26 ottobre 2007 : 04:52:12
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Mi ricordo di avere avuto problemi simili.
Vedere le bande di tubulina ad occhio nudo non è poi così raro...
Esponi la lastra per 1-2 secondi e dovresti essere a posto. Non lasciare la lastra troppo a lungo nel liquido di sviluppo. Puoi anche aspettare un po' prima di sviluppare la lastra (10-20 minuti dovrebbero bastare) e la luminescenza diminuirà permettendoti di usare esposizioni un po' più lente.
Altre cose che puoi fare sono diminuire i tempi di incubazione e la concentrazioni degli anticorpi ed aumentare la lunghezza dei lavaggi. |
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giorgio75
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 26 ottobre 2007 : 07:54:19
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Per il fatto che a piccole differnze di proteina mi corrispondono segnali di intensita' molto diversa a cosa puo' essere dovuto? Tieni conto che ho fatto anche una sorta di curva standard con lo stesso campione ed effettivamente al raddoppiare della proteina il segnale cresce di una decina di volte almeno. Non c'e' una correlazione diretta quindi.
Non dovrebbe essere cosi'. In teoria con i valori delle intensita' delle bande di housekeeping dovrei riuscire a normalizzare le quantita' da caricare..
Grazie comunque per prima. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 26 ottobre 2007 : 08:06:34
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Citazione:
Tieni conto che ho fatto anche una sorta di curva standard con lo stesso campione ed effettivamente al raddoppiare della proteina il segnale cresce di una decina di volte almeno. Non c'e' una correlazione diretta quindi.
Non so se mi aspetterei un aumento lineare del segnale all'aumentare della concentrazione del campione, poichè la tua non è una misura diretta della proteina.
Il legame degli anticorpi non varia necessariamente in modo lineare al crescere della concentrazione del substrato e soprattutto la reazione della HRP sarà più lenta quando ce ne è di meno, e quindi potrebbe dare luminescenza diversa.
Le due bande che hai confrontato (con le 2 concentrazioni diverse di proteina) erano sullo stesso gel? Conta che non puoi confrontare tra loro bande da due western diversi.
Ad ogni modo io non mi preoccuperei così tanto del rapporto tra le intensità della tubulina alle 2 concentrazioni quanto del rapporto tubulina/proteina di interesse alle due concentrazioni. Se il rapporto è più o meno lo stesso sei a posto, cambia uno dei parametri che ti dicevo sopra fino a che non sei soddisfatto della lastra che ottieni e poi mantieni quei parametri per tutti i tuoi esperimenti successivi! |
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giorgio75
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 26 ottobre 2007 : 09:00:16
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Si ovviamente sullo stesso, 4 conc ed in doppio. Il rapporto alle diverse conc tra houkeeping e proteina cambia e anche abbastanza. penso sia dovuto proprio al fatto che non c'e' linearita'. Per questo dovrei normalizzare tutti i campioni. Per ora posso confrontare tra di loro solo i campioni con uguale b-actin content, ma non mi basta. Ho differenti gruppi di animali ed e' importante poter fare anche una statistica. Inoltre dati e foto da paper...
Mi ero preocupato che la quantita' di prot fosse troppo bassa forse e potesse contribuire ad un errore sistematico, ma non penso sia il caso..che dici?
Al limite cambio ECL se e' il caso...
I dati, ad occhio, sono comunque interessanti. Grazie e ciao
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 26 ottobre 2007 : 13:32:16
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Io ti direi di caricare poca proteina, in modo da avere comunque una banda della proteina di interesse ed una banda dell'actina che non sia esageratamente saturata. Poi rapporti ogni campione alla sua actina. Se fai correre i campioni in doppio, hai più campioni per i vari gruppi dovresti e riesci a ripetere l'esperimento più volte direi che ti potrai sentire abbastanza sicuro che i risultati sono reali.
Alla fine a te ciò che interessa è la differenza fra controlli e trattati, l'actina la usi appunto per normalizzare.
Ovviamente per una pubblicazione uno vorrebbe avere le bande dell'housekeeping tutte belle uguali senza sbavature etc. ma soprattutto se lavori con proteine da tessuto la variabilità è una cosa con cui devi convivere. |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 26 ottobre 2007 : 14:06:09
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Esponi la lastra per 1-2 secondi e dovresti essere a posto. Non lasciare la lastra troppo a lungo nel liquido di sviluppo. Puoi anche aspettare un po' prima di sviluppare la lastra (10-20 minuti dovrebbero bastare) e la luminescenza diminuirà permettendoti di usare esposizioni un po' più lente.
Altre cose che puoi fare sono diminuire i tempi di incubazione e la concentrazioni degli anticorpi ed aumentare la lunghezza dei lavaggi.
anche io ho problemi simili con le catene degli anticorpi quando faccio le immunoprecipitazioni. un'altra alternativa è lasciar sfumare il segnale come diceva chick e provare ad esporre due lastra una sull'altra:la prima darà un segnale fortissimo ma in genere la seconda viene più pulita e apprezzi meglio le differenze di intensità, se ce ne sono. almeno io così ho avuto buoni risultati.
una domanda: ma dopo il dosaggio normalizzi i valori di proteine nei tuoi campioni?
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Non riesco a normalizzare un western blotting..
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