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maia84
Nuovo Arrivato
43 Messaggi |
 Inserito il - 03 gennaio 2006 : 21:34:34
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Ciao,qualcuno per caso saprebbe spigarmi come viene utilizzato un vettore per il clonaggio a singolo filamento come M13? So che mi permette di ottenere un filamento pronto per essere sequenziato ma non mi è chiara la procedura a partire dall'inserimento dell'inserto...
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
 Inserito il - 04 gennaio 2006 : 13:37:00
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"Il fago M13 possiede un genoma a DNA circolare chiuso a singolo filamento delle dimensioni di circa 6 Kb. E’ un batteriofago sesso-specifico: per potere infettare una cellula batterica deve legarsi all’estremità dei pili prodotti sulla superficie dei batteri che portano un plasmide di tipi F. Quando il DNA di M13 entra nella cellula batterica, esso viene convertito durante l’infezione in E.coli tale genoma viene convertito in una molecola a doppio filamento: forma replicativa (RF), attraverso la sintesi del filamento complementare. La RF viene replicata mediante la produzione di una copia circolare a singolo filamento di uno dei due filamenti della RF stessa. Poiché la produzione dell’intermedio a singolo filamento richiede la presenza di segnali specifici sul DNA, viene prodotto sempre lo stesso filamento. La replicazione continua del DNA fagico porterà alla produzione di molte molecole di forme RF, che potranno essere purificate mediante i metodi convenzionali che si utilizzano per i plasmidi. Quando il fago termina la sua replicazione può dare inizio alla produzione di nuove particelle fagiche che potranno andare a infettare nuovi batteri. Le nuove particelle fagiche sono costituite dal DNA genomico a singolo filamento, che viene estruso attraverso la membrana cellulare e rivestito dalle proteine che formano il capside. A differenza del fago lambda, la caratteristiche del capside non determinano le dimensioni del genoma fagico, ma la lunghezza della particella fagica filamentosa è detrminata dalle dimensioni del genoma a singola elica: cioè non esistono limiti per l’impacchettamento del genoma di M13, anche se al crescere delle dimensioni del DNA le particelle fagiche diventano sempre più fragili.
Quando il fago M13 fuoriesce dalla cellula batterica non ne determina la lisi. La cellula batterica resta vitale, anche se cresce molto lentamente, e continua a produrre particelle fagiche.
I vettori M13, derivati dal fago M13, esistono sotto due forme: la forma replicativa a doppio filamento, che può essere manipolata come un qualsiasi vettore plasmidico, e la forma a singolo filamento, che è quella secreta dalle cellule infettate.
I vettori M13 sono costituiti da forme RF (a doppio filamento) che sono state ingegnerizzate mediate l’aggiunta di un MCS (multiple cloning site), e del sistema della beta-galattosidasi per il saggio immunoistochimico per la determinazione dei ricombinanti.
Il DNA ricombinante nudo viene utilizzato per trasformare le cellule ospiti, e per dare luogo alla prima progenie fagica in grado di infettare nuove cellule. Le cellule trasformate vengono quindi mescolate con del “soft agar”, che contiene molte cellule batteriche non infettate. La miscela di soft agar e cellule trasformate viene viene versata sopra uno strato di agar normale, contenuto in una capsula Petri. Il soft agar si distribuisce al di sopra dell’agar duro, formando uno strato gelatinoso in cui sono sospese le cellule batteriche: quelle che sono state trasformate contengono il DNA fagico, mentre le altre non sono state ancora infettate. Le piastre vengono incubate o.n. per consentire la crescita batterica e l’infezione fagica.
Le cellule trasformate con il DNA nudo daranno luogo alla prima progenie fagica, la quale fuoriuscirà dal batterio e sarà in grado di infettare nuove cellule.
La consistenza dell’agar molle consente alla progenie fagica di diffondere, ma non troppo lontano, in maniera che vengano infettate solo le cellule che crescono nelle immediate vicinanze. Il risultato di vari cicli di infezione è la formazione di una placca: uno spazio circolare chiaro nella distesa opaca delle numerose cellule batteriche non infettate. Le cellule batterche non infettate crescono densamente nel soft agra, mentre le cellule batteriche infettate crescono molto lentamente, dando origine ad uno spazio chiaro.
Poiché il DNA fagicoè stato ingegnerizzato si utilizza la selezione blu-bianco per discriminare le placche contenti fagi ricombinanti. Se si isolano particelle fagiche presenti nel sovranatante di una cultura liquida, dopo avere precipitato i batteri per centrifugazione, esse conterranno DNA in singola elica. Le proteine di rivestimento del capside fagico vengono rimosse con fenolo e il DNA a singolo filamento può essere purificato.
A causa del processo di replicazione filamento-specifico sarà sempre lo stesso filamento ad essere presente in tutte le particelle fagiche.
Quando si effettua un clonaggio direzionale (usando due enzimi di restrizione presenti nel polilinker) è possibile conoscere “a priori” quale elica sarà presente nella particella fagica.
Se per il clonaggio viene usato un solo enzima di restrizione, bisognerà sequenziare ciascun clone per conoscere l’orientamento dell’inserto." |
 
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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