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Dionysos
Moderatore

D
Cittā: Heidelberg


1913 Messaggi
Inserito il - 03 maggio 2008 : 19:05:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho un bel problemone.

Da circa 6 mesi sto lavorando ad un progetto di silenziamento inducibile
usando un vettore homemade che dirige l'espressione tet-dipendente di shRNA
diretti verso un enzima housekeeping (endogeno in cellule Hela).

Dalla sequenza di due siRNA sperimentalmente efficaci, ho ricavato
e clonato due shRNA corrispondenti in un plasmide homemade di tipo
inducibile (precisamente: presenta un promotore H1 modificato con
l'aggiunta di un elemento tetO). Nonostante il vettore sia giā
stato largamente utilizzato con successo in letteratura, nel mio
caso non sembra funzionare per nulla!

L'attivitā enzimatica del mio target non vuole saperne di calare
e il suo trascritto non sembra subire variazioni significative
in RT-PCR semiquantitativa, nemmeno dopo transienti in tutte le
salse e neppure dopo selezione di cloni selezionati e quindi
stabilmente integranti il plasmide in questione!!!

Inizio a dubitare del sistema inducibile scelto: utilizzo una
linea cellulare di Hela stabilmente integrante il transattivatore
tTA2, che funziona perfettamente con l'espressione di proteine
diretta da promotori CMV (si spegne a concentrazioni crescenti
di doxaciclina) ma che non sembra fare una mazza col promotore H1
nč in presenza nč in assenza totale di doxaciclina.

Problema: questa cosa DEVE riuscire prima di giugno.

Qualcuno ha un qualche minimo consiglio da darmi?
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontā e della libertā
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!

Dionysos
Moderatore

D

Cittā: Heidelberg


1913 Messaggi
Inserito il - 19 maggio 2008 : 21:42:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
sostanzialmente...nessuno ha mai lavorato con vettori esprimenti shRNA ?
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontā e della libertā
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paolo865
Utente Junior


Prov.: Como
Cittā: Olgiate Comasco


262 Messaggi
Inserito il - 29 maggio 2008 : 21:41:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di paolo865 Invia a paolo865 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho visto clonare un shRna in un vettore usando un piccolo stratagemma:
usare l'inserto non defosforilato e defosforilare solo il plasmide. Non ne ho avuto un esperienza diretta quindi non ti so dire di pių...
ciao
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Dionysos
Moderatore

D

Cittā: Heidelberg


1913 Messaggi
Inserito il - 30 maggio 2008 : 10:01:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh č uno stratagemma abbastanza comune per il clonaggio plasmidico.
Fortunatamente il clonaggio mi č andato bene: la cosa problematica
č l'espressione!
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