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atropos
Nuovo Arrivato
Città: Firenze
52 Messaggi |
 Inserito il - 02 giugno 2008 : 12:15:50
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Ciao a tutti!!!
Scusate se ho postato lo stesso messaggio in un' altra sezione ma questa mi sembra più corretta!
Sapete spiegarmi come si effettua lo screening mediante PCR?
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 02 giugno 2008 : 12:19:08
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| dipende cosa vuoi trovare. sii più preciso |
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atropos
Nuovo Arrivato
Città: Firenze
52 Messaggi |
Inserito il - 02 giugno 2008 : 12:22:02
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Per trovare un "gene d'interesse".
Cioè se voglio produrre un topo transgenico per microiniezione una volta ottenuta la progenie devo selezionare quelli effettivamente transgenici.
Sul libro c'è scritto che si può fare o tramite Southern blotting o tramite PCR!
Con la PCR tra l'altro c'è scritto che si fa rapidamente!
Come mai?
Help!
Grazie! |
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Ayla
Utente Junior
Città: Wageningen
573 Messaggi |
Inserito il - 02 giugno 2008 : 14:05:01
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| perché se conosci la sequenza di questo gene puoi disegnare dei primers specifici che ti consentano di amplificare selettivamente quel gene, quindi nei topi trasformati otterrai una banda, e negli altri no. Spero di aver capito bene... |
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atropos
Nuovo Arrivato
Città: Firenze
52 Messaggi |
Inserito il - 02 giugno 2008 : 16:55:11
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Intanto grazie a tutti per l'interessamento!
Ma io non capisco come mai è meglio la PCR del Southern! 
Cioè nel Southern io prendo il DNA.....e lo faccio ibridare con una sonda radioattiva complementare al gene d' interesse.
Dall' autoradiografia poi vedrò quali sono gli individui transgenici.
E' così vero?
Invece con la PCR mi devo costruire i primer(estremità 5' e 3')del gene d'interesse, poi prendere il DNA e fare la PCR.
A questo punto i frammenti ottenuti devono comunque essere analizzati tramite Southern.........o mi sbaglio?
Aiutatemi!
Non riesco proprio a capire la differenza e perchè lo screening con la PCR sia migliore e più rapido!!! |
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Simona84
Utente Junior
Città: milano
131 Messaggi |
Inserito il - 02 giugno 2008 : 20:52:21
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no gli amplificati basta caricarli su un gel di agarosio con un marker e vedere se la lunghezza corrisponde, mentre fare un S.blot è molto più laborioso e costoso, senza tener conto che si usa il radiattivo!invece i primer si disegnano facilmente, non sono molto costosi e la reazione di PCR è veloce, massimo tre ore più fai mezz'ora per far correre gli amplificati su gel ed è fatto! in ogni caso ricorda che anche se l'esperimento ti indica che il frammento si è integrato nel genoma non è detto che questo venga espresso!perchè questo potrebbe essersi inserito in regioni eterocromatiche e quindi sottoposte a silenziamento genico!quindi bisogna fare anche una analisi per l'espressione dell'mRNA e della proteina codificata dal tuo transgene! ciao spero di aver chiarito i tuoi dubbi!
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atropos
Nuovo Arrivato
Città: Firenze
52 Messaggi |
 Inserito il - 03 giugno 2008 : 10:54:22
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Ciao Simona84!
Si grazie ora ho capito!
Ma come marker cosa intendi?Non penso un semplice marker di PM sennò come faccio a capire che è veramente il mio gene?
Poi un favore!
Puoi guardare anche questa discussione correlata?.........sono molto confuso!
Ti metto qui il link http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=8270
Grazie!
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Simona84
Utente Junior
Città: milano
131 Messaggi |
Inserito il - 03 giugno 2008 : 11:19:56
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| un marker è un campione che viene caricato sul gel insieme ai tuoi e che contiene frammenti di acido nucleico di peso molecolare diverso. i frammenti migreranno a seconda del loro pm, quelli più pesanti migreranno meno rispetto a quelli con peso molecolare inferiore. facendo poi una retta di taratura col marker in base al peso molecolare di ogni singola banda e alla distanza percorsa sul gel potrai trovare il peso molecolare indicativo della tua banda andando ad interpolare lo spazio percorso dalla banda del tuo campione con la retta di taratura. |
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Simona84
Utente Junior
Città: milano
131 Messaggi |
Inserito il - 03 giugno 2008 : 12:35:49
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ho trovato anche due immagini per il marker e la retta di taratura. spero che siano utili per aiutarti a capire!
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atropos
Nuovo Arrivato
Città: Firenze
52 Messaggi |
Inserito il - 03 giugno 2008 : 16:22:02
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Grazie Simona84!
Ho capito.
Scusa x il disturbo!
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Discussione |
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Screening mediante PCR
Didattica e Relazioni
