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Discussione |
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DOCTOR
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: roma
2 Messaggi |
 Inserito il - 26 febbraio 2005 : 20:07:52
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ciao ragagazzi il 9 ho l' esame di genetica e biologia molecolare...il mio prof tiene tanto ad un argomento cioè il topo ko ma la dispensa che mi ha consegnato è scritta tutta in inglese...sapete darmi delle notizie su questo benedetto esperimento?
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Gabriele
Utente
Prov.: Pisa
Città: Pisa
615 Messaggi |
Inserito il - 27 febbraio 2005 : 02:17:39
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| Scusami ma non capisco bene,vuoi sapere cos'è un animale ko o vuoi la descrizione di un particolare tipo di esperimento?In tal caso quale?Di topi ko ne ho visti di diversi tipi (o meglio,ko per diversi geni) |
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe." |
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DOCTOR
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: roma
2 Messaggi |
Inserito il - 27 febbraio 2005 : 10:17:50
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| l'esperimento sul topo ko la procedura e ciò che è successo dopo l'esperimento,se ti può essere di aiuto parlava anche di chimera |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 02 marzo 2005 : 13:24:39
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Forse sarebbe da chiarire un po' il significato di topo ko...
Allora, un topo (o cmq un ratto, un lievito o qualsiasi essere vivente) knock-out è un topo transgenico a cui siano stati eliminati, tramite tecniche di biologia molecolare (essenzialmente tramite ricombinazione omologa), uno o + geni, permettendo quindi di studiare la funzione di quel gene vedendo cosa succede quando manca.
In pratica inserisci in staminali embrionali il tuo transgene, costituito dalle sequenze fiancheggianti al gene che vuoi eliminare senza però il gene all'interno. In questo modo x ricombinazione omologa il tuo costrutto si inserirà precisamente al posto del gene di interesse, che sarà quindi eliminato.
Parte dei topi nati da queste cellule sarà transgenico e mancante del gene (lo controlli banalmente con una pcr).
Dopo un tot di incroci fra topi transgenici (credo almeno alla 5a-6a generazione) sei sicuro di avere una linea di topi omozigoti x la mutazione tutti uguali fra loro e quindi puoi procedere allo studio delle differenze con i topi normali.
Poichè tuttavia non puoi sempre eliminare un gene senza conseguenze fatali x l'animale, spesso si usano animali chimerici. Guarda qui x altre info :
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=422
Ciao e in bocca al lupo x l'esame
nICO |
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dallolio_gm
Moderatore
Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna
2445 Messaggi |
Inserito il - 02 marzo 2005 : 14:03:07
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Sai che la tecnologia del knock-out (nn vorrei dire una sciocchezza, ma credo anche questo esperimento) è dovuta ad un italiano? Si chiama Mario Capecchi, ma qui in Italia, naturalmente non lo conosce nessuno... :)
Allora, innanzitutto fare knock-out vuol dire eliminare la funzionalità di un gene: in genere il modo più semplice è quello di sostituire il primo esone con un'altra sequenza, magari un marcatore (come lacZ) in modo che questo nn possa venire trascritto/tradotto (ad es. manca il codone d'inizio).
Nel lievito fare ko è relativamente facile, perchè questo organismo preferisce la ricombinazione omologa, cioè fra due seq. simili di DNA.
Negli eucarioti superiori invece, il problema è più complesso, perchè la ricombinaz. avviene più spesso tra 2 seq. casuali.
Questo è il motivo per cui è stato necessario architettare tutto quell'esperimento che stai studiando: bisogna far avvenire la ricombinazione tra un plasmide ed il gene corretto, e bisogna utilizzare degli opportuni marcatori in modo da poter selezionare poi solo i casi in cui è avvenuta ricombinaz. omologa.
Il knock-out viene fatto sulle cellule staminali (ES); una volta modificate e selezionate, queste vengono inserite in un embrione.
L'organismo che crescerà, se le ES attecchiscono, sarà una chimera, cioè un individuo in cui una certa percentuale delle cellule possiede il genoma originale e le altre quello modificato.
Se le ES attecchisono bene, c'è la possibilità che nell'organismo che cresce, almeno una parte delle cellule germinali possiedano il genoma modificato; in questo modo, attraverso una serie di incroci, sarà possibile ottenere dei topi omozigoti per il knock-out.
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Il mio blog di bioinformatics (inglese): BioinfoBlog
Sono un po' lento a rispondere, posso tardare anche qualche giorno... ma abbiate fede! :-) |
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diamond
Nuovo Arrivato
Prov.: Pisa
Città: pisa
1 Messaggi |
Inserito il - 06 marzo 2005 : 20:02:34
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ciao,
io ho dato il tuo stesso esame a febbraio e forse ti posso aiutare..
questi sono i miei appunti che avevo riscritto al pc..
CREARE UN ORGANISMO TRANSGENICO
Significa introdurre geni esogeni o forme alterate di un gene endogeno in tale organismo.
Knockout di un gene: inattivare la copia normale di un gene sostituendola con una sua forma mutante ottenuta in vitro per poter risalire alla sua funzione in vivo. Quindi si inattiva un gene e si vede cosa succede all’individuo (fenotipo) senza quel gene.
Knock out in un topo:
1. Si introducono alleli mutanti nelle cellule ES (cellule staminali embrionali)
2. Le cellule ES trasformate sono introdotte in embrione di topo nelle prime fasi dello sviluppo, ottenendo delle chimere
3. Topi chimerici vengono fatti riprodurre per vedere se la mutazione è presente nelle cellule germinali
4. Topi eterozigoti per la mutazione vengono incrociati per ottenere topi omozigoti
Mutagenosi in vitro:
produco un gene diverso e sicuramente non funzionante in un plasmide.
1. Si vuole ottenere una copia alterata del gene che viene diviso in tre parti A, B e C.
2. Ad esempio lo cambio eliminando la parte B
3. Per farlo devo inserire il gene in un plasmide
4. Aggiungo un oligonucleotide modificato.
5. Faccio un ibridazione tra i due e faccio copiare il plasmide dalla DNA polimerasi
6. Si usa un oligonucleotide d-CTP modificato (che contiene zolfo e non fosfato: S-dCTP)
7. Faccio agire un enzima che degrada il DNA (che contiene fosfato) e che quindi non mi degrada quello modificato che ha lo zolfo. Praticamente digerisce solo il fosforo.
8. La cellula non lo riconosce e non lo digerisce.
9. Faccio copiare il tutto e ho un plasmide modificato che contiene il gene mutato.
Trasferimento di DNA in cellule eucarioti:
- digestione enzimatica della parete del DNA da parte dell‘esonuclesi III per trasferirlo nelle cellule eucariotiche
- selezione cellule ricombinanti.
- introduzione direttamente del DNA dal mezzo di coltura o per elettroporazione.
La copia modificata del gene deve scambiarsi con il DNA della cellula. Il gene cattivo deve scambiarsi con il gene buono. DNA plasmide ? DNA cellula.
Infine per selezionare i ricombinanti si può fare:
una selezione positiva: si cerca il gene per la resistenza all’antibiotico, quindi si riconoscono le cellule che hanno inserito il plasmide con la resistenza all’antibiotico. L’antibiotico mei serve per riconoscere le cellule senza il plasmide.
una selezione negativa: si cerca il gene per la tirosina kinasi (tk) per assicurarsi che sia avvenuta una ricombinazione omologa.
La tirosina kinasi è in grado di modificare il ganciclovir (la sostanza che si aggiunge x la rivelazione) e di renderlo tossico poiché se la ricombinazione non avviene in modo perfetto, oltre al gene s trova anche il gene buono.
• Se la ricombinazione è omologa la copia modificata va a sostituire perfettamente il DNA e non si attiva la tirosina kinasi, quindi le cellule con l’aggiunta di ganciclovir non muoiono. Il gene per la tirosinachinasi non è nel DNA del topo insieme al gene modificato.
• se la ricombinazione non è omologa (avviene su un sito diverso), con l’aggiunta di ganciclovir si attiva la tirosina kinasi e le cellule muoiono.
Un buon sistema per distinguere fenotipicamente i topi che hanno accettato le cellule trangeniche è l'utilizzo di 2 ceppi cellulari di topi con colore del manto differente, le chimere risulteranno infatti striate. Supponiamo di avere i topi con manto bianco e i topi transgenici con manto nero, una volta individuate le chimere (con manto striato), queste verranno fatte incrociare con i topi bianchi fino ad ottenere topi con manto completamente nero. Ciò avviene quando le cellule di interesse entrano a far parte della linea germinale del topo, a questo punto avremo ottenuto un topo con tutte le cellule del corpo eterozigoti per il nostro transgene. Il passo successivo è quello di incrociare tra di loro i topi neri per ottenere omozigoti. La prole seguirà la classica distribuzione mendeliana, quindi si tratterà soltanto di selezionare i topi giusti.
Dagli omozigoti si capirà se il gene che stiamo studiando è fondamentale per la sopravvivenza oppure no.
Processo:
1) si prelevano cellule da blastocisti (le cellule staminali embrionali) e si mettono in coltura.
2) Si inserisce il costrutto con il gene modificato nelle cellule e si inseriscono le cellule ricombinanti in una blastocisti (che sarà formata da cellule sane e cellule modificate).
3) Si impianta la blastocisti modificata nell’utero di una femmina pseudo-gravida.
I^ generazione --> avrò delle chimere sane (supponendo che il gene modificato mi dia il colore nero)
II^ generazione (chimere + chimere) --> avrò topi neri ( si ottengono topi neri quando la modifica del gene è presente nelle cellule germinali, inoltre sono eterozigoti, cioè hanno tutte e due le copie uguali)
III^ generazione --> al 25% ottengo un topo KO puro nero (omozigote),
al 50% ottengo un topo eterozigote nero
al 25% ottengo un topo omozigote bianco
Il gene è un marcatore che mi permette di riconoscere il fenotipo e di vedere su cos’altro agisce il gene, ma a volte i geni modificati vengono compensati e l’effetto finale non si vede.
I topi chimerici vengono fatti riprodurre per vedere se la mutazione è presente nelle cellule germinali.
Knockout in fase adulta:
la modificazione avviene in un topo adulto e non nella blastocisti in quanto il topo potrebbe morire.
Processo:
1) Introduco delle sequenze particolari, gli introni, che poi non vengono trascritti.
2) Nel primo topo Inserisco loxP negli introni affianco all’esone n°2.
3) Nel secondo topo inserisco la proteina cre (un promotore) che ricombina il loxP staccando l’esone.
4) Incrociando i topi tra loro il trascritto viene modificato e l’esone n°2 viene distrutto
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Shasa
Nuovo Arrivato
12 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2007 : 12:01:07
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ciao ragazzi, una delle domande dello scorso compito di ingegneria genetica era: se ho un topo transgenico KO per un gene letale in età adulta, posso ottenere un topo transgenico omozigote?quali possibilità,come e quando (non si tratta del sistema Cre-Lox).
voi cosa rispondereste? |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2007 : 14:06:14
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 non riesco a capire la domanda.
hai un topo ko per un gene letale (significa letale anche in eterozigosi?)e devi rendere omozigote questo stesso topo o da questo topo vuoi ottenere una progenie omozigote?
di getto mi è venuto da pensare al backcrossing o all'interference, ma forse sto vaneggiando.... |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Shasa
Nuovo Arrivato
12 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2007 : 14:32:56
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| sinceramente quando ho letto la domanda ho pensato che a partire da quel topo dovessi ottenere una progenie omozigote,ma non ne sono sicura visto che formulata così com'è non mi sembra avere molto senso....o semplicemete un senso ce l'ha ma io non ci arrivo!! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2007 : 22:35:51
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Credo che la domanda sia da intendere così:
Se faccio il KO del gene X il topo nasce, ma non riesce a sopravvivere fino all'età adulta (e quindi non si può riprodurre).
Posso in questa situazione ottenere dei transgenici KO omozigoti?
L'unico modo che mi viene in mente sarebbe un sistema Cre-loxP con l'espressione di Cre sotto controllo di un promotore tet (attivato da tetraciclina o composti simili) oppure dei promotori sensibili alla dieta (es. alla [] di ferro nella dieta). |
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Shasa
Nuovo Arrivato
12 Messaggi |
 Inserito il - 09 settembre 2007 : 00:26:26
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grazie per l'illuminazione chick!! |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 17 settembre 2007 : 06:43:27
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Credo che la domanda sia da intendere così:
Se faccio il KO del gene X il topo nasce, ma non riesce a sopravvivere fino all'età adulta (e quindi non si può riprodurre).
Posso in questa situazione ottenere dei transgenici KO omozigoti?
L'unico modo che mi viene in mente sarebbe un sistema Cre-loxP con l'espressione di Cre sotto controllo di un promotore tet (attivato da tetraciclina o composti simili) oppure dei promotori sensibili alla dieta (es. alla [] di ferro nella dieta).
La cre sotto il controllo del promotore tet, on o off che sia, non darebbe dei risultati buoni, anzi complicherebbe non poco la situazione ed il topo non sarà mai abbastanza wild type o knock out.
Sarebbe più opportuno utilizzare la CreERT o la CrePRT, che è inducibile con un farmaco e niente tossicità in vivo, pur conservando la possibilità di avere un knock-out tessuto specifico.
La percentuale di espressione del gene x prima dell'induzione è 100%, con l'attivazione della cre per qualche giorno potresti raggiungere facilmente 80% di knock-out e forse più.
Credo che la domanda possa essere interpretata in molti modi, a me è capitato di leggere un articolo in cui hanno fatto un topo transgenico KO che nell'età adulta grazie al cambiamento della catena pesante della miosina cardiaca può esprimere un cDNA uguale al gene eliminato definitivamente...
aspetta... mi spiego meglio
allora c'è fisiologicamente nel muscolo cardiaco c'è il cambiamento della catena pesante della miosina cardiaca quando il topo arriva all'età adulta, ovvero quando il topo è giovane funziona un gene, mentre quando diventa adulto si spegne questo gene e incomincia ad attivarsi il gene della catena pesante della miosina cardiaca adulta.
Hanno utilizzato il promotore di questo gene espresso nell'età adulta per recuperare alcune funzioni perse dal topo KO.
Questo metodo lo hanno definito KO di terza generazione, ovvero Wild type->KO tessuto specifico->riespressione del gene in età adulta.
Forse però la domanda è semplice e mira solamente a capire se lo studente ha capito l'importanza dell'eterozigosi etc... di conseguenza vorrebbe una risposta molto semplice
"...se ho un topo transgenico KO per un gene letale in età adulta, posso ottenere un topo transgenico omozigote?quali possibilità,come e quando..."
La risposta è ovviamente sì, anche se il topo morirebbe in età adulta, poiché la linea transgenica murina potrebbe mantenersi in costante eterozigosità, ed i figli omozigoti nascerebbero per poi morire in età adulta.
Le possibilità dipendono dalle problematiche che impongono la morte del topo... se i topi omozigoti morirebbero prima o dopo aver raggiunto la fertilità, se i topi sono fertili, se sono vitali etc etc.
Nel caso i topi muoiano prima della fertilità sarebbe possibile vedere ed analizzare i topi eterozigoti adulti o piccoli, omozigoti piccoli e wild type adulti o piccoli
Come? basta accoppiare gli eterozigoti per mantenere la linea.
Quando? per i topi etero va bene sempre, per i KO dopo la fertilità e prima della morte 
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 17 settembre 2007 : 07:11:00
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In realtà mi dicono che esistono nuovi promotori tet che sono molto puliti e hanno livelli di trascrizione di base praticamente nulli. Non li ho mai usati però, quindi non sono sicurissimo che ciò sia vero. :)
Tet comunque era solo un esempio: ci sono promotori sensibili ad es. al tamoxifene che funzionano molto bene (sempre che il tamoxifene non vada ad interferire nei tuoi esperimenti ovviamente). 3-4 giorni di iniezioni di tamoxifene ed il tuo topo è diventato knockout. Sembra che questi funzionino bene (ne stiamo testando una linea in questo periodo).
Poi è chiaro che il tutto dipende da che esperimento vuoi fare. |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 17 settembre 2007 : 13:41:30
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Forse si tratta proprio della linea CreERT (Cre Estrogen Receptor 2 Tamoxifen)
in pratica non è il promotore inducibile, ma la Cre è fusa con il dominio di legame agli ormoni del recettore degli estrogeni. Questo dominio di legame ER è modificato per riconoscere solo e specificamente il tamoxifene, che in questo caso funge da agonista. In pratica quando dai il tamoxifene il dominio ER della Cre si attiva e permette l'ingresso della ricombinasi nel nucleo cellulare per esplicare la sua funzione... idem per CrePR ma si attiva con l'antagonista del progesterone.
Per la tecnologia Tet ho dei dubbi sulla pulizia, specie nei topi transgenici... il problema sta nel fatto di mantenere la tessuto specificità o quantomeno le caratteristiche basali del gene che modifichi.... però effettivamente non sono aggiornato sugli ultimi ritrovamenti 
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 18 settembre 2007 : 00:19:49
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Ah ok allora magari parlavamo della stessa cosa :)
Chiederò alla persona che sta testando i topi e mi faccio spiegare come funzionano. |
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lyerin
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2008 : 09:27:51
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Ciao ragazzi ieri ho avuto l'esame scritto di Ingegneria genetica e una domanda mi ha messo letteralmente in crisi. cito testualmente:
"con il knock out di un gene si intende l'eliminazione dell'attività di quel gene, ma per ricombinazione omologa posso anche SOSTITUIRE UNA MUTAZIONE? se sì indicare come e quali controlli usare."
Qualcuno sa dirmi come risponderebbe a questa domanda? Non so dirvi neanche come andava fatta perchè il professore me l'ha spiegata durante l'esame ma.. ero talmente distrutta psicologicamente che non ho capito molto.. grazie!! |
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topo ko
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