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marconemo86
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
 Inserito il - 13 giugno 2008 : 12:03:41
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ciao a tutti,
sono nuovo del forum e avrei subito una richiesta da fare. avrei bisogno di un protocollo o almeno una spiegazione ben dettagliata per la rilevazione di popolazioni apoptotiche, necrotiche e normali in citofluorimetria; stessa richiesta inoltre per quanto riguarda il rilevamento del DNA cellulare per valutare gli stati del ciclo cellulare!
Grazie mille
Marco
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Biotecnologo1987
Nuovo Arrivato
Prov.: Teramo
Città: teramo
100 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2008 : 15:34:20
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| Allora innanzitutto devo tener presente che c'è una differenza sostanziale tra i 2 processi...: l'apoptosi è ALTAMENTE programmato come fenomeno mentre la necrosi è inaspettata...La maggiorparte delle cellule in un tessuto è in fase G1 xkè rappresenta la fase più lunga del ciclo cellulare...il campione per il citofluorimetro deve essere liquido xkè lo strumento richiede un vero e proprio flusso di cellule...le fasi basilari sono: 1 lavaggio con PBS di cellule adese poi aggiungi una soluz edta/tripsina x staccare le cellule e contemporaneamente chelare il ca che è un attivatore di molti sistemi enzimatici, dopo alcuni minuti aggiungiamo un terreno adeguyato contenente siero che a sua volta contiene l'inibitore della tripsina...fatto questo procediamo alla trattamento con etanolo al 10% che permeabilizza le membrane dopodichè eseguiamo la colorazione col propidium...il citofluorimetro separerà le cellule G1 dalle S in base all'emissione della fluorescenza...altro passaggio è quello di trattare con una RNAse che degrada rna altrimenti interferirebbe sull'analisi...con l'apoptosi le cellule venngono confinate in vescicole altrimenti medierebbero una risposta infiammatoria e nell'esattezza AUTOIMMUNE...quindi x rilevare questa fase devi rilevare sullo spettro del citofluorimetro un picco isodiploide xkè da una cellula diploide si saranno formate cellule figlie ipodiploidi cioè con contenuto di DNA inferiore...sul gel d'agarosio vedresti una ladder di bande xkè le nucleasi apoptotiche tagliano il DNA regolarmente ogni 150-200 bp...prima però di mettere il campione in citofluorimetro devi far correre le pompe solo con h2o per pulire i circuiti...questo è il principio ma l'esperimento non l'hanno fatto fare a noi xkè era un esperimento delicato quindi sulle quantità non posso aiutarti...ciao!!! |
Davide* |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2008 : 19:23:15
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guarda che la fissazione in etanolo (10%?io la faccio al 70%,boh dipenderà dalle linee di pensiero )si fa per l'analisi del ciclo cellulare ma non puoi discriminare le cellule normali dalle necrotiche/apoptotiche, per quelle bisogna usare l'annexina/propidio. quando ho un attimo ti scrivo i protocolli del ciclo e dell'apoptosi  |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2008 : 19:35:44
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allora..APOPTOSI
-raccogliere le cellule, lavarle in PBS e contarle
-diluire in binding buffer 1:4 con H2O distillata (però non so se si diluisce 1:4 perchè è il nostro che è 1:4 o è un discorso generale), considerando di usare 2 ml/tubo per il lavaggio dopo l'incubazione con l'annexina, 190 ul/tubo per risospendere le cellule prima di aggiungere il propidio e un tot in più che ti serve per andarci a risospendere le tue cellule in modo da averle ad una concentrazione di 2-5x10^5/ml
-prelevare 195 ul della sospensione e aggiungerci 5 ul di Annexina-FITC, mescolare e lasciare incubare 10' a temperatura ambiente (sotto cappa)
-lavare con i 2 ml/tubo di buffer 1X, 1200rpm 5'
-risospendere in 190 ul di buffer (e considerando che generalmente dopo aver svuotato i tubi ti rimangono comunque circa 100 ul di buffer io ne aggiungo solo 90)e aggiugere 10ul di propidio ioduro 20 ug/ml subito prima di leggere (concentrazione finale 1ug/ml)
cerca di rispettare il più possibile i rapporti perchè il propidio si lega in maniera stechiometrica e dato che non lavi se i rapporti non sono rispettati ti sballa la lettura, idem se si fa passare troppo tempo dall'aggiunta del PI al momento della lettura perchè finisce per legare anche parte delle cellule apoptotiche che perciò rilevi come necrotiche
il principio su cui si basa questo test è il fatto che nel processo apoptotico si ha uno scompaginamento della membrana cellulare che espone all'esterno la fosfatidilserina, normalmente sul foglietto interno, che viene riconosciuta e legata dall'annexina marcata con un fluorocromo (FITC). le cellule necrotiche invece avendo la membrana danneggiata permetono al propidio di entrare e legarsi al DNA. il propidio non è marcato perchè è fluorescente di suo |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
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Biotecnologo1987
Nuovo Arrivato
Prov.: Teramo
Città: teramo
100 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2008 : 23:34:43
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| si hai ragione mi sono sbagliato io...noi abbiamo fatto l'analisi al citofluorimetro ma solo sul ciclo cellulare e le relative alternative dal punto di vista morfologico ma non abbiamo preparato campioni x l'apoptosi...è molto utile il citofluorimetro...HO UNA DOMANDA X TUTTI I LETTORI... SI POTREBBE UTILIZZARE UN AB PER LA TELOMERASI X RILEVARE CELLULE NEOPLASTICHE?? |
Davide* |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 16 giugno 2008 : 21:41:51
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allora continuando..ciclo cellulare
- prima di tutto si va a fissare le cellule in etanolo
> reagenti : soluzione salina (PBS + EDTA preparato "in casa" , filtrato o autoclavato. conservare a 4°C) ed etanolo 96% (conservare a -20°C)
> mantenere in ghiaccio i reagenti
> contare e centrifugare le cellule in provette di polipropilene (le falcon classiche) per evitare l'adesione delle cellule alle pareti
>dopo aver lavato asciugare il pellet e risospendere in ghiaccio il pellet accuratamente (3-6 x 10^6 cells/ml)in 1ml di etanolo 96%, usando una p1000
>aggiungere goccia a goccia 3 ml di etanolo 96% in agitazione su vortex, in modo da raggiungere la concentrazione finale etanolo 70%. E' importante mantenere in agitazione e aggiungere l'etanolo goccia a goccia per evitare l'aggregazione delle cellule
> conservare a 4°C o a -20°C fino al momento della colorazione
- colorazione DNA con Propidio ioduro (PI)
>centrifugare per togliere il fissativo 1000-1200 rpm 10'
>lavare in PBS
>lavorando sempre in ghiaccio incubare 2-4 x 10^6 cellule con 2 ml di PI 10-20 ug/ml + 25 ul RNAsi a temperatura ambiente per X minuti, oppure PI 2,5-5 ug/ml + 25 ul di RNAsi overnight a 4°C. questo tempo però è quello che uso io perchè su tumori solidi, se si fa su linfociti invece l'incubazione è di 120'. per altre tipologie cellulari non so dirti per quello ho messo X minuti
il PI si prepara da una madre di 20 mg in 1000 ml di PBS e si diluisce al momento
dopo la colorazione non si lava |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 16 giugno 2008 : 21:43:37
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per quel che riguarda le procedure di acquisizione risulta un po' difficile spiegarlo senza immagini e simili. ah volevo inserirli nei protocolli ma non sapevo quale fosse la sezione migliore in cui postarli |
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Rilevamento Apoptosi e ciclo cellulare FACS
Didattica e Relazioni
