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Discussione |
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fpotpot
Utente
Città: middleofnowhere
1056 Messaggi |
 Inserito il - 29 ottobre 2007 : 13:57:40
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Salut!
qualcuno usa o ha usato la MALDI TOF?puo' andare bene se si guarda all'interazione tra due proteine di basso peso molecolare (circa 5000 Da entrambe)?vi ringrazio per qualsiasi informazione!
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cuccurullom
Nuovo Arrivato
Città: napoli
14 Messaggi |
Inserito il - 31 ottobre 2007 : 14:48:06
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Dovresti spiegarmi meglio il problema...
comunque, immaginando che tu abbia due polipeptidi di circa 5000 Da ciascuno, con il MALDI TOF (preferibilmente in modalità lineare) hai buone speranze di verificarne la presenza sia che esse siano slegate che se hanno interagito. Nel primo caso, infatti, noterai due segnali distinti, nel secondo caso invece un unico segnale corrispondente alla somma delle loro masse.
Per poter determinare con certezza la loro identità, comunque, sarebbe preferibile un sequenziamento. Una digestione triptica ed un'analisi in LCMS sarebbero l'ideale. In alternativa, spesso è possibile Fare un PSD (POst Source Decay) direttamente con il MALDI.
Spero di esserti stata utile |
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fpotpot
Utente
Città: middleofnowhere
1056 Messaggi |
Inserito il - 31 ottobre 2007 : 22:14:58
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| grazie er la risposta!..ammazza suona complicatissima la seconda parte..il mio problema è : due peptidi che si in teoria dovrebbero interagire tra di loro ma debolmente,vorrei sapere se con questa tecnica si può vedere anche interazioni deboli o si deve fare uno spettro nmr delle due proteine miscelate in soluzione? |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 31 ottobre 2007 : 23:41:42
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| magari in Biacore... |
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fpotpot
Utente
Città: middleofnowhere
1056 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2007 : 13:42:54
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Bia che? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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fpotpot
Utente
Città: middleofnowhere
1056 Messaggi |
Inserito il - 02 novembre 2007 : 09:34:10
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| grazie del link!sembra una cosa molto attendibile,ora ci guardo qualche articolo..vorrei solo un indizio..è costosa? |
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LaP
Nuovo Arrivato
Città: Milano-Bologna
14 Messaggi |
Inserito il - 02 luglio 2008 : 23:13:16
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Nel caso volessi usare la spettrometria di massa MALDI (es hai lo strumento) stai attento a non alterare l'interazione tra i tuoi peptidi durante la preparazione del campione.
Mi spiego: se spotti il tuo campione con una matrice es. acido sinapinico (ideale per pesi superiori ai 5kDa, la soluzione non deve contenere acetonitrile o altri solventi che distruggerebbero l'interazione.
Prova una soluzione al 100% acqua (eventualmente con 0.1%TFA).
l'ideale sarebbe una liquido-massa con cromatografia non denaturante es gel filtration.
Buon lavoro |
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RNA world
Utente Junior
370 Messaggi |
Inserito il - 03 luglio 2008 : 11:12:47
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Secondo me il MALDI non è una tecnica di ionizzazione abbastanza soft per mantenere le interazioni non covalenti proteina-proteina, invece l'ESI è più indicata a questo scopo. Con il MALDI puoi ad esempio valutare la stechiometria di legame proteina - ligando come spiegavano sù, cioè andando a vedere la differenza di PM del picco con solo la proteina e di quello con il ligando.
ciao
PS: 5000 Da è il massimo del TOF in modalità reflectron... |
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LaP
Nuovo Arrivato
Città: Milano-Bologna
14 Messaggi |
Inserito il - 03 luglio 2008 : 12:43:54
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Lo studio per valutare la stechiometria di legame (differenza di PM) valuta la formazione di una nuova specie ionica composta dall'addotto non covalente dei due analiti e, quindi, l'identificazione di una interazione non covalente.
All'interno di una valutazione delle tecniche di ionizzazione di per se definite soft (rispetto a impatto elettronico, ionizzazione chimica, ecc) non sono d'accordo che la tecnica MALDI sia meno soft dell'ESI, basti pensare che se analizzi uno standard di BSA potrai facilmente osservare oltre ai picchi mono, bi ed eventualmente tricarica (dipende dalla concentrazione), anche un picco a massa 133kDa composto dal dimero MH+ (un addotto non covalente).
Di fatto sebbene il MALDI usi un desorbimento con un laser, che nell'immaginario è un agente ionizzante potente, è anche vero che gli analiti sono letteralmente annegati nella matrice che assorbe interamente l'energia del laser. Difatto il laser serve solo per desorbire e dare energia cinetica, la ionizzazione è data dagli urti con la matrice (debole acido organico) e proprio questi urti possono dare eventualmente l'eccesso di energia per le frammentazioni.
Daltra parte non possiamo neanche definire l'ESI più soft del MALDI pensa che il capillare è a 200°C, e sottoposto ad un potenziale di 3000V (la corrente di casa è 220V)!
Come accennavo prima, il principale problema nello studio con SdM delle interazioni non covalenti non è tanto composto dalle tecniche covalenti, bensì dal processamento del campione.
L'acetonitrile così come molti altri agenti, è in grado di denaturare le proteine già a basse concentrazioni (interazioni idrofobiche e disidratazione ad alte conc), i sali in soluzione (aumento forza ionica) rompono i legami ionici, ponti idrogeno e vanderwaals, e così via.
Per questo ho accennato ad una cromatografia gel filtration che di per se è in grado di separare gli addotti e la massa, anche nell'eventualità in cui non sia in grado di visualizzare l'addotto intero, può misurate gli analiti da cui è composto. Comunque, come per tutti gli esperimenti in condizioni nuove, non resta che provare per valutare il sistema....
Al di la di questo piccola chiaccherata, anche io credo che il biacore sia lo strumento di eccellenza per la valutazione delle interazioni non covalenti. Solo non so se ci siano limiti dovuti al peso degli analiti ed al fatto che, dovendo immobilizzarne uno sul chip, questo possa presentare problemi di ingombro sterico in caso di piccoli peptidi. Ammetto la mia ignoranza su questa tecnica.
Buon lavoro a tutti |
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nuna
Nuovo Arrivato
48 Messaggi |
Inserito il - 03 luglio 2008 : 16:11:52
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| io sarei per l'NMR... con una buona interpretazione degli spettri riesci ad ottenere molte informazioni e in più non è una tecnica distruttiva... io ho lavorato con acidi nucleici e ho verificato l'interazione con un antibiotico, devo dire i risultati sono stati eccezionali ed il lavoro è stato pubblicato. |
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Maldi tof
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