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Alessia
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
59 Messaggi |
 Inserito il - 01 settembre 2008 : 19:30:50
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Ciao a tutti, può darsi che già c'è stata questa conversazione ma non riesco a trovarla. Cmq devo genotipare dei topi e devo estrarre il DNA dalle code. Non trovo un protocollo decente, fatto bene al dettaglio con tutti i prodotti, quantità e tempi di incubazione. vi premetto che l'omogenizzazione la faccio con il rotore della Qiagen con le palline stainless. a parte questo non so altro, nemmeno il buffer di lisi. indi vi prego aiutatemi senno il mio capo mi lincia  . inoltre volevo domandarvi come si fa a vedere, una volta estratto il DNA, se i topi che ho sono omozigoti o eterozigoti e se inoltre si può vedere se sono omozigoti recessivi o dominanti
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Seh
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 01 settembre 2008 : 21:27:33
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Ciao Alessia, sono nuova del forum ma penso di saperne abbastanza in fatto di genotipizzazione da code. In primo luogo, non sempre puoi capire se un animale è omozigote o eterozigote, dipende da cosa stai guardando e da come sono fatti i tuoi primer, in genere questo si fa in real time, ma come detto prima dipende da cosa devi guardare.
Per quanto riguarda l'estrazione io mi trovo bene con un protocollo che utilizza fenolo:cloroformio:isoamilalcool, dopo aver lisato i campioni aggiungo un volume di questa roba, li mescolo bene e li lascio in rotazione a RT per una mezzoretta, poi centrifugo per 10 minuti a RT e trasferisco la fase acquosa in una nuova provetta, per precipitare uso 0,1 volumi di sodioacetato e 2 volumi di EtOH assoluto, mescolo per inversione una trentina di volte e poi trasferisco il pellet in una eppendorf con 400ul di EtOH 75% per il lavaggio, da qui rispospendo in 30 ul di H20 sempre per trasferimento del pellet. Viene abbastanza pulito e anche se sembra un po' macchinoso è piuttosto semplice.
Per quanto riguarda il buffer di lisi non saprei aiutarti perchè utilizzo un metodo diverso.
Se però vuoi un consiglio ci sono delle colonne di purificazione che funzionano abbastanza bene... poi dipende da quanti campioni preventivi di dover estrarre.
Spero sia utile ^^ |
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elly_
Utente Junior
400 Messaggi |
Inserito il - 01 settembre 2008 : 21:39:38
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per la lisi delle code io faccio:
Proteasi K 0.1mg/ml in buffer di lisi (100mM tris pH8.5, 5 mM EDTA, 0.2%SDS, 200mM NaCl).
0.5 ml di questa soluzione per ogni eppendorf, incubare a 56°C overnight (anche 3 ore) in agitazione.
spinnare a 14K per 5min, preparare eppendorf con 0.5 ml isopropanolo, trasferire surnatante, mischiare per inverisione, spinnare a 14K per 1 min, via il surnatante, lavare con 0.5ml EtOH 70% e spinnare come prima. Via il surnatante, asciugare pellet DNA. risospendere con H2O. poi PCR o quello che vuoi!
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data
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
89 Messaggi |
Inserito il - 02 settembre 2008 : 09:10:30
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| Sigh, non metto le mani sulle provette da secoli ma ricordo che io dopo la lisi (che facevo nel buffer della pcr + proteinasi K [per le concentrazioni dovrei rabattare...] e 56C o/n o se c'era fretta "spezzettando" le code con un puntale, ahem :), poi 7' a 95C per inattivare la proteinasi e 14000 rpm per 2') usavo direttamente 1 ul per fare la pcr. |
http://www.medito.eu.org/vodka/odierno |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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