| Autore |
Discussione |
|
|
aitan3
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
71 Messaggi |
 Inserito il - 01 ottobre 2008 : 19:01:30
|
Cari avete mai sentito parlare di RT-PCR in situ ?...sembra essere una nuova tecnica che consente di sentetizzare cDNA, amplificarlo utilizzando u nucleotde marcato con un antigene e poi rilevare l'amplificato mediante una reazione antigene-anticorpo.
Qulacuno di voi ne sa qualcosa in piu? se puo essere fatta con colture di cellule murine ? qualche link da segnalare o qualche ditta a cui posso chiedere?
Grazie mille a chi risponderà
|
|
|
|
|
frau_frosch
Utente Junior
Città: Boston
225 Messaggi |
Inserito il - 03 ottobre 2008 : 11:57:42
|
Ciao aitan3!
Certo che è fattibile con cellule murine! In pratica usi un primer specifico per la tua RT-PCR e dei nucleotidi marcati.
In realtà il metodo di rilevamento con anticorpo è UNO dei tanti possibili. Puoi usare infatti una marcatura diretta o indiretta. Ad esempio per la marcatura diretta puoi effettuare l'RT-PCR usando 1 nucleotide fluoromarcato (ovviamente gli altrinon lo saranno). Oppure puoi usare un sistema con digossigenina o biotina (ad esempio, incorporando nucleotidi biotinilati e trasportando i fluorofori associati a streptavidina direttamente sul cDNA amplificato)...insomma, gli stessi principi di marcatura di una FISH normale.
Ovviamente, lavorando con DNA devi fare particolare attenzione agli step di digestione proteica e del DNA.
Ho trovato un documento in ipertesto molto esauriente, puoi dargli un'occhiata se ti va di approfondire:
http://www.bioscience.org/1996/v1/c/nuovo1/htmls/list.htm
Spero di essere stata utile..ciaoo |
 |
|
|
aitan3
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
71 Messaggi |
Inserito il - 03 ottobre 2008 : 13:04:48
|
Caro frau ma tu hai mai effettuato questo tipo di tecnica?
sapresti dirmi per sommi i capi come si procede partendo da una coltura di cellule staminali murine?
Attendo una tua risposta..grazie infinite
|
|
|
|
morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 04 ottobre 2008 : 10:27:11
|
| non mi è chiara una cosa.... a cosa può servire questa tecnica? quantificare la trascrizione? |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
|
|
|
frau_frosch
Utente Junior
Città: Boston
225 Messaggi |
Inserito il - 04 ottobre 2008 : 18:05:51
|
@morgan79: be' ti permette di avere segnali a singola cellula. Ad esempio, se hai un tessuto ottenuto da una biopsia tumorale, potresti voler sapere se le tue cellule neoplastiche esprimono un dato gene. Ad esempio, a lezione noi facevamo l'esempio della valutazione dell'espressione di geni virali di HBV in HCC. Volendo potresti anche fare estrazioni, ma (a meno di usare una laser capture microdissection) è probabile che ti porti dietro mRNA da cellule vicine...
@ aitan3: mai fatto personalmente, ma l'ha fatto il mio prof. ti conviene cercare su pubmed un protocollo apposito, ma in generale dovrai fissare le tue cellule (solitamente per le fish si fissa con una soluzione metanolo:acido acetico= 3:1). Poi digerisci proteine e DNA...insomma, in generale quell'ipertesto lo spiegava bene ;)
Cmq intendevo dire che puoi partire da qualsiasi cellula (uomo, topo, bue muschiato..) ihih. 
PS: se dall'ipertesto clicchi su references trovi una serie di papers..di sicuro ci saranno i protocolli in materials and methods! |
|
|
|
aitan3
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
71 Messaggi |
Inserito il - 04 ottobre 2008 : 21:32:40
|
si si vedere i paper lo fatto, pero sai spesso è meglio avere dei consigli da chi la tecnica l'ha fatta direttamente.
Cmq grazie mille.
Buon lavoro |
|
|
| |
Discussione |
|
RT-PCR in situ
Didattica e Relazioni
