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Alebiotech
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 08 ottobre 2008 : 15:35:48
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Ciao a tutti, sono nuova!
non so se era il caso di aprire una nuova discussione per questo, però non ho trovato una discussione adatta.
Allora ho fatto una trasfezione stabile con le CHO, con un vettore che serve per l'espressione di anticorpi ricombinanti in cells di mammifero che usa come marcatore di selezione l'acido micofenolico.
Il mio problema è che la mia proteina è espressa molto poco nel supernatante, mentre quella di controllo, il cui gene è stato costruito in modo del tutto identico alla proteina d'interesse, viene espressa di più.
Ho già fatto i controlli di sequenziamento del DNA ed è tutto ok.
La mia domanda è questa: non è che per caso una selezione troppo stringente può diminuire l'espressione della proteina. io uso una concentrazione di acido micofenolico di 10 ug/ml, concentrazione scelta dopo aver fatto una curva di crescita con le CHO in presenza dell'antibiotico e che corrisponde alla concentrazione alla quale le cellule erano tutte morte dopo 5 gg.
Se avete altri suggerimenti....GRAZIE!!!!!!
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2008 : 18:03:35
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Prima di dare la colpa all'agente di selezione, che comunque non spiegherebbe
il diverso comportamento dei controlli, io verificherei se la sensibilità del
saggio che usi per quantificare il controllo è paragonabile a quella del saggio
che usi per quantificare il prodotto d'interesse.
Il gene è stato costruito in modo identico, ma il metodo con cui saggi
l'espressione potrebbe essere completamente diverso (ad es. un saggio
di microscopia per un controllo GFP non può essere paragonato ad un
western per cercare la tua prot, non per una valutazione quantitativa). |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 17 ottobre 2008 : 21:49:03
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trasfezione stabile....che fatica!
l'integrazione del vettore è casuale e spesso può capitare in una zona del genoma dove non è assicurata una espressione ad alti livelli, ecco perchè si selezionano almeno una decina di colonie trasfettate, si saggiano per PCR per scartare eventuali falsi positivi e sui positivi si saggia l'espressione mediante western o real time o saggio della betagalattosidasi per vedere quale delle colonie assicura elevati livelli di espressione. Questo è il modo di procedere che uso io |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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Michy981
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 12 dicembre 2008 : 23:57:08
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| Ciao Blog. Ma se trasfetti con una GFP taggata al tuo plasmide e poi verifichi il livello della tua trasfezione verificando al cell-sorter in tempi diversi, per esempio, 24 o 48 h, non hai un'idea della resa? La trasfezione stabile non è difficile, devi trovare la giusta ratio del plasmide da utilizzare, per il resto è facile con i nuovi prodotti che trovi in commercio. Altro aspetto: se trasfetti un plasmide con una resistenza ad un determinato antibiotico, e poi piastri le tue cellule amplificate in un mezzo contenente l'antibiotico contro cui hai inserito la resistenza tu selezioni le cellule, e sei sicura che esprimono il tuo plasmide. |
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ValeCGC
Utente
746 Messaggi |
Inserito il - 13 dicembre 2008 : 09:24:35
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scusa..ma se ho ben capito tu come selezione usi una resistenza all'acido micofenolico dato che piastri con quello no? quello che non capisco è perchè controlli l'espressione della selezione...se è una resistenza le cellule che restano vive sono quelle in cui il trasferimento ha avuto successo, le altre muoiono.
io non credo che una alta concentrazione di acido possa interferire con l'espressione genica, ma non so in che modo agisce questo composto e come si esprime la sua tossicità...però credo che se 'silenziasse' i geni non te lo avrebbero fatto usare eheh
poi hai detto che il gene del marcatore selezionabile è stato costruito in modo identico a quello che vuoi amplificare..allora dovrebbe essere influenzata anche la sua espressione. cosa che non ti risulta.
io dico che devi valutare la selezione semplicemente in base alle cellule che restano vitali dopo i 5 giorni di coltura,che sono quelle trasfettate, poi controlli i dna delle sopravvissute e vedi quali hanno amplificato con successo e quali sono falsi positivi.
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