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Vero-HA
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2 Messaggi |
 Inserito il - 23 novembre 2008 : 10:46:47
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Ciao a tutti...
sono una tesista di biotecnologie. Lavoro su lievito e sto cercando in tutti i modi di immunoprecipitare una proteina dai nuclei.
Chiedo il vostro aiuto...magari avete qualche consiglio da darmi.
La mia proteina è taggata con HA e utilizzo la resina della Roche per gli IP.
Ho usato sia il metodo manuale che il kit della Pierce. Ho provato a varie le concentrazioni di alcuni buffer, ad aggiungere la benzonasi..ma niente..la proteina non si immunoprecipita.
Qualcuno conosce qualche metodo alternativo di frazionamento nucleo-citoplasma?
Grazie in anticipo e complimenti per il sito:)
Vero
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Michy981
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 12 dicembre 2008 : 23:26:54
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Ciao blog.Dunque se ho ben capito vuoi immunoprecipitare una proteina nucleare? Non ho mai provato, quindi prendi con le pinze quel che sto per scrivere, ma non puoi provare ad eseguire sulle tue cellule una estrazione nucleo citoplasma, così da andare ad isolare i nuclei per poi causare la lisi della loro membrana, pellettare, e lavorare squisitamente sul pool proteico nucleare? Ci sono molti protocolli sulla estrazione nucleo-citoplasma, e una buona parte non richiede un kit, quindi non credo ci siano neppure molti limiti di costo.
Ciao
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Vero-HA
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 18 dicembre 2008 : 19:38:27
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Ciao chick, grazie mille...avevo già guardato quei protocolli
Ciao Michy,
sisi..per immunoprecipitare la proteina prima estraggo nucleo-citoplasma!
Ho provato sia con KIT che con metodi manuali.
Comunque credo di avere capito cosa mi impedisce di fare l'immunoprecipitazione, ma non so come risolvere il problema.
Non so per quale motivo ma il buffer per la sferoplastizzazione dà fastidio all' immunoprecipitazione.
L'ho capito perchè giusto settimana scorsa facendo un controllo: ho provato a immunoprecipitare questa proteina da estratto proteico ma trattando prima le cellule con il buffer per ottenere gli sferoplasti e non è venuta, mentre senza il trattamento con questo viene tranquillamente.
Il problema è che la sferoplastizzazione è l'unico modo per rompere la parete...almeno che io sappia!!!!
:(
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Immunoprecipitazioni nuclei
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