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Spillo
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 04 gennaio 2009 : 17:53:54
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Ciao a tutti sono uno studente di biotecnologie.
Qualcuno saprebbe indicarmi una semplice procedura per valutare se un gene x (che è stato distrutto in un ceppo di lievito) è coinvolto nella risposta ai danni all'apparato mitotico?
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 04 gennaio 2009 : 18:23:11
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non so nello specifico se è la rispoata che cerchi, in ogni caso puoi vedere se facendo il KO del gene o la sua down regulation le cellule entrano in mitosi. per le cellule di mammifero puoi vedere lo stato dei cromosomi marcando con un colorante per nucleo come hoechst che dovrebbe funzionare anche in lievito.
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 04 gennaio 2009 : 18:47:25
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Dopo il KO o il KD, si potrebbe fare un challenge test
provocando danni all'apparato mitotico e.g.con farmaci
che disorganizzono i microtubuli (taxolo, colcemid..)
mantenuti a concentrazioni sub-tossiche, cioè tali
da permettere comunque ai tuoi controlli wild-type
di riparare i danni e portare a termine la mitosi.
Se il gene è effettivamente coinvolto in quel che dici
dovresti ottenere una situazione del genere :
> Controllo wild-type trattato -> mitosi (danni riparati)
> Controllo wild-type non trattato -> mitosi (nessun danno)
> KO (o KD) trattato -> NO mitosi (danni NON riparati)
> KO (o KD) non trattato -> mitosi (nessun danno)
In vitro puoi misurare la proliferazione 'a occhio'
(stato di confluenza al microscopio) oppure con BrdU
o cristalvioletto. Altrimenti puoi visualizzare un
eventuale blocco mitotico con staining dei cromosomi
- come detto da Iside - e/o If anti tubulina.
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Spillo
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 05 gennaio 2009 : 13:13:06
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grazie mille per le risposte :)
e se invece dovessi verificare se è un gene del checkpoint mitotico come dovrei procedere? |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 05 gennaio 2009 : 21:15:12
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ma a quale checkpoint ti riferisci? innanzitutto potresti vedere l'espressione del gene durante la mitosi poi in genere il discorso è sempre lo stesso. cioè, se interferisci per il tuo gene, sincronizzi (per esempio con afidicolina o timidina per bloccare in fase S) e sevedi che le cellule si arrestano in G1 o G2 puoi dire che quel gene è effettivamente coinvolto nel checkpoint (salvo eventuali meccanismi compensatori che, ti assicuro, in mitosi sono abbondanti). fai uno staining per marcare la fase del ciclo (per esempio, in G2 puoi valutare i centrosomi, in G1 onestamente non saprei e al momento non ho molto tempo per dare un'occhiata). prendendo in prestito lo schemino di dionysos 
ctrl -> mitosi (il tempo dipende dalla linea cellulare, ad esempio le HeLa vanno in mitosi dopo 12 o 13h)
trattato -> blocco in G1/G2 (allo stesso tempo del ctrl) |
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Danni all'apparato mitotico
Didattica e Relazioni
