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fabdipi
Nuovo Arrivato
35 Messaggi |
 Inserito il - 07 maggio 2006 : 18:36:25
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Ciao a tutti vorrei sapere quali sono i passaggi e le tecniche che si devono seguire per allestire al meglio una coltura cellulare possibilmente eucariotiche qualsiasi partendo da un tessuto e arrivando alle cellule di quel tessuto pure.Poi da queste cellule pure come si fa a metterle in piastra quali sono i parametri chimici fisici da considerare per farle proliferare.
Possibilmente dovrei avere il maggior numero di informazioni possibili grazie.
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 07 maggio 2006 : 22:19:28
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Dipende da che tessuto e che cellule vuoi coltivare.
In generale dovrai disgregare il tessuto (es. proteinasi K o tripsina, piu' disgregamento meccanico), poi dovrai usare medium apposta per le colture primarie, ma qui mi fermo perche' dipende da quale tipo cellulare usi! Facci sapere piu' info e ti sapremo (spero) aiutare! |
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fabdipi
Nuovo Arrivato
35 Messaggi |
Inserito il - 08 maggio 2006 : 11:54:42
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essenzialmente all'università ci hanno posto un quesito...
Cioè che una ricercatrice ha una coltura cellulare ( non specifica il tessuto ) in piastra in un incubatore..Con grande sorpresa si accorge che la coltura invece di proliferare muore.Quali possono essere le possibili cause?Non ci hanno detto altro.Da escludere i parametri fisici chimici ( pH temperatura,ecc. ) uindi cercavo la risposta nella preparazione della coltura ma non so da dove iniziare.. se qualcuno puo aiutarmi ne sarei felice.. grazie |
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pisola83
Nuovo Arrivato
28 Messaggi |
Inserito il - 08 maggio 2006 : 12:14:06
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| dipende sempre dal tipo di cell che hai in coltura. magari sono morte perchè non sono state splittate e quindi può succedere che se si tengono in coltura delle cellule per un tempo relativamente lungo, queste possono inizialmente raggiungere una elevata concentrazione in coltura e sucessivamente morire perchè sono troppe rispetto al volume e al terreno di coltura della piastra e perchè nel proliferare hanno esaurito i nutrienti del terreno. oppure se le cellule muoiono si può ipotizzare una contaminazione di agenti patogeni.i fattri possono essere molti, e un pò difficile però identificare quello giusto perchè la tua domanda è molto generica. |
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fabdipi
Nuovo Arrivato
35 Messaggi |
Inserito il - 08 maggio 2006 : 16:15:14
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| grazie per la risposta, lo so la domanda è generica ma così è stata posta.che cosa intendi per splittare?? |
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salto
Utente Junior
Prov.: Parma
Città: Fidenza
165 Messaggi |
Inserito il - 08 maggio 2006 : 23:30:14
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Scusate se mi aggancio a questa discussione
Volevo sapere se tra gli utenti del forum c'e' qualcuno che ha realizzato qualche tipo di cultura cellulare.
Qualcuno che e' riuscito a prelevare le cellule da un tessuto ed e' riuscito a farle vivere in vitro.
Grazie |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2006 : 01:09:14
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Io l'ho fatto una volta nell'ultimo lab "didattico" all'uni.
Ora faccio altro e non ne ho la necessità ma solitamente non è niente di trascendentale, sicuramente molti qui hanno familiarità con queste tecninche.
Curiosità mia: come mai ti interessa? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2006 : 02:04:37
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fabdipi, splittare è un'italianizzazione dell'inglese split che significa dividere.
In generale quando coltivi delle cellule le metti in una piastra o in una fiasca contenente del terreno di coltura (liquido o solido che sia).
Le cellule usano i nutrienti del terreno per crescere e dividersi, ma ovviamente a un certo punto i nutrienti cominceranno a scarseggiare, i prodotti di scarto ad aumentare, e le cellule a essere troppe.
I primi due problemi si risolvono facilmente cambiando il terreno, in genere ogni 2/3 giorni, il terzo problema si risolve "splittando" le cellule, cioè dividendole in più piastre.
Es. nella tua piastra metti 10 milioni di cellule. Dopo 4 giorni ne hai 30 milioni (numeri ipotetici, dipende da che cellule usi). Le risospendi e le dividi in 3 piastre da 10 milioni ciascuna.
Un altro motivi per cui le cellule potrebbero morire è che non tutti i tipi cellulari sono adatti da mettere in cultura. Per alcune cellule (es. neuroni) servono terreni speciali e bisogna lavorare con molta cura, perchè sono particolarmente delicate.
Per Salto: io ho lavorato sia con linee prestabilite (tumorali) sia con colture primarie (cioè prendendo cellule da tessuto) di astrociti. Al momento sto mettendo su una nuova serie di esperimenti con colture primarie di neuroni. |
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biomolecola
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Napoli
40 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2006 : 14:40:03
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| io parto da linfociti umani e li immortalizzo con EBV per creare linee linfoblastoidi... |
W la ricerca |
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fabdipi
Nuovo Arrivato
35 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2006 : 15:20:36
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grazie a tutti per i suggerimenti...Ho scoperto pero che il medium di sospensione per le cellule, è stato conservato in un frigo dove c'era anche della formaldeide ovviamente chiusa ma che cmq puo essere stata riposta male da qualcuno..( sapete tutti che è molto volatile ).adesso in lab proveremo a fare tre diversi colture cellulari derivate da granulosa follicolare.
1- colture con medium conservato in frigo senza formaldeide
2- colture con medium conservata in frigo con formaldeide in beuta chiusa
3-colture con medium conservato in frigo con formaldeide in beuta aperta.
In questo modo si vedremo se:
a)effettivamente la formaldeide ha inquinato il medium
b)dato che il caso che trattiamo è un caso in cui si ha prima la proliferazione cellulare e poi la morte, vediamo se quando è stato cambiato il medium ( non inquinato ) con quello conservato insieme alla formalina si è provocata la morte delle cellule ( che non è avvenuta per apoptosi ). |
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salto
Utente Junior
Prov.: Parma
Città: Fidenza
165 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2006 : 16:56:14
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Per Chick80 e AleXo
Quando si coltivano cellule in vitro, il mezzo di cultura è una sostanza completamente conosciuta chimicamente?
In altre parole il mezzo viene preparato partendo da molecole elementari:
- x aminoacidi
- y zuccheri
- z vitamine
- ecc
Oppure si sfrutta qualche sostanza che contiene tutte le cose che servano ma senza averne l'esatta composizione?
Grazie |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 10 maggio 2006 : 01:05:10
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X fabdipi: ma veramente pensavano che avreste potuto dare quella risposta??? Io non me lo sarei mai sognato! Ad ogni modo, questo insegna che il medium si conserva in un frigo apposta con solo i reagenti per le colture cellulari, ben chiuso e con parafilm attorno al tappo!
X salto: il medium di base di solito si compra già pronto e contiene componenti definite.
Tuttavia questo è in generale non adatto per far crescere bene le cellule (contiene solo le cose essenziali) e quindi si addiziona con siero come ad es. FBS (fetal bovine serum) o FCS (fetal calf serum) che contiene amminoacidi e proteine varie (un sacco di albumina soprattutto) che è a composizione non definita, in quanto varia a seconda dell'animale da cui lo prelevano.
In alcuni casi al posto del siero si possono aggiungere supplementi a composizione definita, in modo da conoscere esattamente cosa c'è nel terreno.
Di solito quello che si fa è crescere le cellule in medium+FBS e, il giorno prima dell'esperimento, metterle solo nel medium, senza FBS. In questo modo si evita che differenze nella composizione del siero possano influenzare i risultati. |
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salto
Utente Junior
Prov.: Parma
Città: Fidenza
165 Messaggi |
Inserito il - 10 maggio 2006 : 08:45:05
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Citazione:
Tuttavia questo è in generale non adatto per far crescere bene le cellule (contiene solo le cose essenziali) e quindi si addiziona con siero come ad es. FBS (fetal bovine serum) o FCS (fetal calf serum) che contiene amminoacidi e proteine varie (un sacco di albumina soprattutto) che è a composizione non definita
Come pensavo!!!
Io mi domando che senso ha verificare farmaci su culture cellulari non sapendo esattamente la composizione del mezzo?!?!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 10 maggio 2006 : 10:31:22
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Beh, le colture cellulari non sono un organismo, quindi non vanno bene per testare un farmaco, medium conosciuto o meno... l'uso che se ne fa e' solo una cosa iniziale, ma prima di mettere un farmaco in commercio bisogna passare attraverso la sperimentazione su animali e poi alla sperimentazione clinica (sull'uomo). Sinceramente non credo che l'uso di medium a composizione conosciuta (che comunque si possono usare) cambierebbe molto i risultati nel 99% dei casi. Ad ogni modo, come ti dicevo, di solito il siero viene tolto il giorno prima di fare l'esperimento, quindi il medium e' a composizione definita.
Per anticipare una possibile domanda... non si parte direttamente dagli animali per motivi etici ed economici. |
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salto
Utente Junior
Prov.: Parma
Città: Fidenza
165 Messaggi |
Inserito il - 10 maggio 2006 : 20:47:59
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Mi spiego meglio.
Il trascurare quel "piccolo" particolare di utilizzare l'FBS non e' una cosetta da poco. Questo fatto semplicemente non ti permette di capire come funziona una cellula.
Se uno vuole veramente capire, innanzitutto deve caipre quali sono le sostanze indispensabili per tenerla in vita.
Bisogna conoscere tutte le molecole, nella loro esatta percentuale.
In ordine di priorita' questo dovrebbe essere il primo passo.
Che senso ha studiare l'interno della cellula se non si conosce nemmeno le sostanze che la circondano?
Inoltre penso che capire la composizione chimica del mezzo sia piu' facile che capire come funziona il DNA, o sbaglio?
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 10 maggio 2006 : 22:40:09
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Beh, la composizione del siero e' nota (anche perche' e' in gran parte albumina), quello che non e' noto e' la concentrazione delle varie componenti che puo' variare da lotto a lotto.
Ribadisco comunque, che gli esperimenti in vitro sono fatti su di un modello cellulare che, essendo un modello e' diverso dalla situazione fisiologica/patologica, anche se puo' essere usato per approssimarla. Se uno vuole essere preciso invece di usare il siero usa un supplemento a composizione definita, ma dubito che le cose cambino. I modelli d'altronde si usano per semplificare la situazione, se cominci a considerare tutte le possibili cascate del segnale dovute ai componenti del siero non arriverai mai ad un risultato.
Per farti un altro esempio: quando studi chimica ti fanno vedere tutte le reazioni fatte con molecole disegnate con sferette o con lettere al posto degli atomi. Questo e' fisicamente sbagliato, perche' l'atomo non e' una pallina. Se pero' volessi studiare una reazione chimica considerando tutte le possibili interazioni degli atomi fra di loro e con l'aria, e considerando tutti i principi di meccanica quantistica ci metteresti 10 anni solo per studiare una semplice reazione che invece studi in 2 minuti con un modello "a pallini". |
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salto
Utente Junior
Prov.: Parma
Città: Fidenza
165 Messaggi |
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salto
Utente Junior
Prov.: Parma
Città: Fidenza
165 Messaggi |
Inserito il - 10 maggio 2006 : 23:39:18
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| volevo dire è vero che ... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 11 maggio 2006 : 12:25:46
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Mah... quell'articolo non e' che mi convinca molto...
Il siero e' generalmente testato per le endotossine, i micobatteri e i virus. Inoltre fanno moltissimi test per valutare i livelli di molti componenti (es. LDH, HDL, colesterolo, ormoni, fattori di crescita etc) per assicurarti di avere un prodotto il piu' simile possibile tra i vari lotti.
Cmq seguimi un attimo: a patto di non cambiare lotto di siero durante l'esperimento (e questa e' una cosa che non si fa mai) le cellule saranno sempre nelle stesse condizioni quando si fa l'esperimento, che tu sappia o meno quello che c'e' dentro.
Quindi, visto che comunque non stai lavorando su di un organismo ma su di un modello, non ci sono problemi. Se vuoi un modello migliore puoi usare un supplemento a composizione nota invece del siero: saprai esattamente tutta la composizione del medium, ma comunque la cosa non rispecchiera' la situazione fisiologica.
D'altronde quando fai la sperimentazione su pazienti non sai la composizione del loro siero, e non verrai mai a conoscenza di tutte le differenze tra i vari pazienti. |
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Tat
Nuovo Arrivato
Città: Milano
33 Messaggi |
Inserito il - 11 maggio 2006 : 12:55:14
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Secondo me inoltre dipende dal tipo di farmaci che devi testare (scusate se mi intrometto...in quanto se devi testare farmaci anti-proliferativi che interferiscano con dei recettori specifici o con i ligandi dei recettori attraverso meccanismi competitivi allora posso dare ragione a salto dicendo che la conoscenza del mezzo può essere importante. Ma quando vai invece a testare farmaci anti-proliferativi (e sono un esempio) più a valle che sfruttano strategie anti-senso allora in quel caso l'unica cosa importante è far entrare bene il farmaco nella cellula e una volta entrato vedere se funziona. Questo passaggio secondo me nelle colture cellulari si può fare benissimo!!!!
P.S. Chick80 dove hai studiato prima di arrivare in Nuova Zelanda e soprattutto la tua elevata preparazione è frutto del tuo percorso didattico o auto-didattico post e durante gli studi???
Grazie |
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salto
Utente Junior
Prov.: Parma
Città: Fidenza
165 Messaggi |
Inserito il - 11 maggio 2006 : 21:29:39
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Citazione:
Cmq seguimi un attimo: a patto di non cambiare lotto di siero durante l'esperimento (e questa e' una cosa che non si fa mai) le cellule saranno sempre nelle stesse condizioni quando si fa l'esperimento, che tu sappia o meno quello che c'e' dentro.
Giusto
Citazione:
Se vuoi un modello migliore puoi usare un supplemento a composizione nota invece del siero: saprai esattamente tutta la composizione del medium, ma comunque la cosa non rispecchiera' la situazione fisiologica.
Giusto. Infatti io ho detto che è sbagliato procedere in questo modo.
Non rispecchia la condizione reale.Devi dirlo ai tui direttori che ti chiedono di lavorare in questo modo
Citazione:
Mah... quell'articolo non e' che mi convinca molto...
Allora ti chiedo tu sei capace di fare un mezzo di cultura partendo da molecole elementari??? Secondo me ti servono un bel mucchio di cellule di scorta prima che riesci a tenerne in vita qualcuna per un po' di giorni heheheh...
Voglio dire che il cercare di capire quali sono esattamente le sostanze che servono per far soppravvivere una cellula, implica il capire cose fondamentali. A questa attivita' bisognerebbe dare piu' peso.
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 11 maggio 2006 : 22:56:29
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Guarda, vai sul sito di Invitrogen e compri del DMEM + un supplemento noto e sei a posto.
Ti leggi la scheda dei prodotti e ti danno tutte le informazioni sul contenuto!
Io comunque lavoro in-vivo, quindi non ho problemi di questo tipo. :D (in realta' sto facendo qualche coltura primaria, ma
1) uso medium a composizione totalmente definita!
2) comparero' i risultati con i risultati ottenuti sugli animali)
PS: ricorda anche che lavorare su cellule e' solitamente molto piu' economico che usare animali...
x tat: io ho studiato a Milano, ho fatto la tesi li' e ora sto facendo il dottorato! |
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pisola83
Nuovo Arrivato
28 Messaggi |
Inserito il - 13 maggio 2006 : 00:57:03
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| ciao fabdipi.mi sono assentata per qualche giorno dal forum ma come ho potuto constatare qualcuno ti ha già detto cosa intendevo con "splittare". |
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Tat
Nuovo Arrivato
Città: Milano
33 Messaggi |
Inserito il - 15 maggio 2006 : 16:12:16
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Grazie Chick80.
Tat
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colture cellulari
Didattica e Relazioni
