Dot blot positivo, WB no

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Paoloragno
Nuovo Arrivato

9 Messaggi

Inserito il - 03 luglio 2009 : 10:15:53

Salve a tutti!

da tempo cerco su omogenati di cervello un'enzima (P450C17, aromatasi per la sintesi di DHEA) mediante WB ma senza alcun risultato. Il protocollo che uso Ã¨ validato (ho lavorato con altre proteine) e mi sento di escludere problemi tecnici sostanziali (anche perhÃ¨ fino al trasferimento, semi-dry, come ho sempre verificato con il Ponceau tutto Ã¨ ok).
La cosa che mi lascia perplesso Ã¨ aver comunque rilevato un segnale mediante Dot-Blot usando stesso anticorpo, alle stesse concentrazioni sullo stesso omogenato. Sto intanto verificando P450C17 con IF su brain slices nelle stesse regioni ma nel frattempo, per quanto riuarda il WB, non so davvero che pesci prendere...magari farÃ² un'immunoprecipitato prima del prossimo WB...
Vi chiedo quindi se avete qualche idea e/o suggerimento.

Grazie!

marok
Utente Junior

150 Messaggi

Inserito il - 03 luglio 2009 : 10:40:17

Ad occhio direi che hai un problema inerente o alla migrazione della proteina o alla stabilità della stessa. Perchè anche se il protocollo è validato l'interazione tra proteina ed anticorpo fa caso a se ogni volta. Forse durante la corsa elettroforetica o il trasferimento la proteina si scassa (lo fai in condizioni denaturanti o no?) e l'anticorpo non è più capace di legarla (l'anticorpo riconosce una struttura secondaria/terziaria o un frammento di sequenza?).
Non sono un esperto in questo campo e provo a darti delle idee piuttoscto che soluzioni.

Paoloragno
Nuovo Arrivato

9 Messaggi

Inserito il - 03 luglio 2009 : 16:34:26

Grazie Marok, è esattamente quello che penso anche io. La corsa tradizionale è in condizioni denaturanti ma ho pensato appunto di eliminare tutti gli agenti fisici (bollitura etc.) e chimici (sostanze nel buffer di loading)che normalmente si utilizzano. Ma, almeno per quanto ho trovato io, nessuno protocollo di WB prevede la non-denaturazione delle proteine. Ti ringrazio comunque per i suggerimenti.