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Philly
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 07 settembre 2009 : 22:33:39
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Ciao a tutti!
Ho seguito un pò la discussione e mi ha già dato nozioni che mi mancavano e che 4 paper non hanno saputo spiegarmi! ora vorrei sapere cosa rappresenta il nostro risultato che esce dal Delta delta Ct. può essere la quantità di DNA maggiore/minore rispetto alla quantità presente nel campione controllo? oppure sono le copie di DNA maggiori/minori rispetto al campione controllo? insomma come diceva il mio prof di matematica "cos'è questo numero, metri, patate, centimetri?
in più come posso mettere in percentuale la quantità del mio gene espresso considerando il mio campione controllo 100%? oppure potrei fare a meno del campione controllo se considero l'housekeeping 100%? ma se poi le efficienze di amplificazione del gene x e del gene housekeeping sono diverse? insomma come potrei settare la mia q-PCR? (dovrei fare un'analisi di chimerismo in una popolazione cellulare e quindi da DNA genomico usando diverse coppie di primer sulla stessa piastra delle quali quindi non posso avere le curve standard perchè sarebbe troppo dispendioso in termini di wells)
Aiut!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
 Inserito il - 07 settembre 2009 : 23:00:28
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Citazione:
può essere la quantità di DNA maggiore/minore rispetto alla quantità presente nel campione controllo? oppure sono le copie di DNA maggiori/minori rispetto al campione controllo?
Il valore relativo al tuo controllo. Che poi parli di copie del gene, o ng di DNA non importa essendo un valore RELATIVO.
Citazione:
in più come posso mettere in percentuale la quantità del mio gene espresso considerando il mio campione controllo 100%? oppure potrei fare a meno del campione controllo se considero l'housekeeping 100%?
Assolutamente no!!! L'housekeeping ti serve per NORMALIZZARE il tuo gene, non va messo al 100%.
Se vuoi fare un confronto dell'espressione del tuo gene fra controllo e trattato devi considerare i Ct del tuo gene nei 2 campioni, non l'housekeeping.
In generale l'housekeeping (nota che se ne dovrebbero usare almeno 2-3 se vuoi fare le cose per bene) deve rimanere costante fra controlli e trattati: questo vuol dire che il tuo trattamento non ha influenzato la trascrizione del DNA per se, ma solamente il gene che stai esaminando.
Siccome ovviamente avrai comunque delle piccole variazioni nell'housekeeping, sottrai a ciascun valore di Ct del tuo gene il Ct dell'hk, in modo appunto da normalizzare questi valori. Ottieni così il delta-Ct. A questo punto puoi calcolare il delta-delta-Ct sottraendo il deltaCt medio dei controlli al deltaCt dei singoli campioni.
A questo punto calcoli 2^(-ddCt) e usi questi valori per confrontare controlli e trattati, mettendo il valore MEDIO di 2^(-ddCt) come 100% e rapportando gli altri valori a questo.
Quindi la MEDIA dei controlli sarà 100% e la media dei trattati sarà qualcosa d'altro, maggiore o minore a seconda del caso. |
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Philly
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2009 : 10:47:01
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Ok! Capito come percentualizzare se cosi si può dire.
Ma nel mio test non tratto cDNA e quindi non è l'espressione del gene che mi interessa. Quantifico su DNA genomico estratto da un campione cellulare misto ed in questo campione devo verificare la quantità di presenza di un gene polimorfico caratteristico di una specifica popolazione cellulare.. quindi vorrei distinguere in percentuale la presenza di una popolazione dall'altra..perciò chiedevo se sarebbe possibile usare l'housekeeping (housekeeping come anche qualsiasi sequenza non polimorfica) direttamente come percentuale totale di DNA e mettere in relazione il segnale proveniente dalla quantità X del mio polimorfismo specifico di quella popolazione!
Grazie per la rapidità di risposta! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2009 : 11:26:08
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Si in questo caso puoi fare una cosa del genere, scegli un qualunque gene che non sia polimorfico o comunque che amplifichi in un punto in cui non lo è e lo usi come "calibratore", quello sarà il DNA totale presente nel tuo campione e lo puoi mettere al 100% e rispetto a questo vai a vedere le % dei vari polimorfismi.
Attenzione però il tutto funziona se le efficienze di tutte le PCR sono "uguali" (o almeno molto simili), altrimenti comunque i tuoi risultati non sono attendibili!
Quindi se in realtà non fai una curva standard per valutare l'efficienza delle PCR (e non devi farlo sempre, basta farlo una volta sola!) non puoi dire che i risultati ottenuti siano attendibili. |
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Philly
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2009 : 11:51:56
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Quindi se le efficienze di amplificazioni sono diverse bisognerebbe normalizzare con la slope ottenuta dalle standard considerandola come efficienza della reazione x? (o forse meglio mi trovo set di primer che mi diano le stesse efficienze?)
Grazie grazie grazie!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2009 : 12:55:17
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Citazione:
Messaggio inserito da Philly
(o forse meglio mi trovo set di primer che mi diano le stesse efficienze?)
 meglio!
Altrimenti non dovresti utilizzare il metodo del delta delta Ct ma dovresti utilizzare l'"efficiency-calibrated method" che tiene conto anche delle efficienze nelle diverse reazioni.
Ti rimando a questo articolo in cui i due metodi vengono discussi: Statistical analysis of real-time PCR data.
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Quantificazione polimorfismi mediante Real-Time
Didattica e Relazioni
