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 Inserito il - 17 settembre 2009 : 09:11:08
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Buongiorno a tutti.
Chiedo scusa da subito per il disturbo, ma non ho molto ben chiara la tecnica del Patch Clamp... Ditemi voi se sbaglio.
Da quanto leggo su delle dispense, questa tecnica ha come scopo quello di andare a studiare il comportamento dei singoli canali membranali (a noi è stata introdotta proprio nell'ambito dello studio di questi).
Con essa è possibile stabilire la CONDUTTANZA di un singolo canale ionico (parametro estremamemnte importante in quanto paragonabile alla permeabilità della membrana nei confronti di uno ione).
Tramite un "elettrodo a depressione" (l'interno dell'elettrodo ha una pressione negativa) si esercita una piccola pressione sulla superficie esterna della membrana cellulare in modo che si venga a generare una intima adesione tra membrana e pareti di vetro dell'elettrodo [si ha così un ottimo isolamento elettrico: si ha solo una piccolissima e trascurabile perdita di corrente ionica dall'interno del microelettrodo al liquido extracellulare].
In questo modo io riuscirò a studiare le correnti che fluiscono attraverso i pochi (o meglio ancora, attraverso l' UNICO) canale presente nella piccola area del patch che ho isolato.
La corrente ionica (dovuta al flusso degli ioni attraverso il canale isolato) viene raccolta dal microelettrodo e inviata all' ingresso invertente (cosa significa "ingresso invertente"?) di un amplificatore differenziale (non è altro che un convertitore corrente- differenza di potenziale che fornisce all'uscita una differenza di potenzile direttamente proporzionale all'intensità di corrente che ha ricevuto).
Tramite un generatore esterno regolabile, si può applicare un POTENZIALE DI COMANDO al secondo ingresso NON INVERTENTE (?) in modo da poter bloccare il potenzile di membrana nell'area del patch (non ne sono sicuro, ma in teoria io blocco il potenziale della membrana nel patch, in modo da poter avere un continuo flusso di ioni attraverso il canale e quindi una continua corrente elettrica che verrà poi raccolta dal microelettrodo, giusto?).
In tal modo posso misurare il flusso ionico attraverso lo specifico canale e potrò ottenere la curva corrente/tensione, la cui pendenza corrisponderà alla CONDUTTANZA.
Scusate la lunghezza del post, ma siccome ho degli appunti frazionati volevo anche sapere se è giusto come discorso.
Ringrazio anticipatamente tutti !
Buona giornata...
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"Non è mai tardi per tentar l'ignoto. Non è mai tardi per andar oltre."
Gabriele D'Annunzio |
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chick80
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Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 17 settembre 2009 : 11:02:06
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Citazione:
Da quanto leggo su delle dispense, questa tecnica ha come scopo quello di andare a studiare il comportamento dei singoli canali membranali (a noi è stata introdotta proprio nell'ambito dello studio di questi).
Con essa è possibile stabilire la CONDUTTANZA di un singolo canale ionico (parametro estremamemnte importante in quanto paragonabile alla permeabilità della membrana nei confronti di uno ione).
E' una delle applicazioni ma non la sola. Ad es. puoi valutare il potenziale di membrana, i parametri dei potenziali d'azione, l'attività spontanea della cellula, la secrezione di neurotrasmettitori e tanto altro. In realtà diciamo pure che oggigiorno il single channel recording è forse l'applicazione meno usata del patch clamp (statistica basata sul fatto che non conosco nessuno che lo fa  !).
Citazione:
Tramite un "elettrodo a depressione" (l'interno dell'elettrodo ha una pressione negativa) si esercita una piccola pressione sulla superficie esterna della membrana cellulare in modo che si venga a generare una intima adesione tra membrana e pareti di vetro dell'elettrodo
Vero, anche se quello che si fa in pratica è applicare prima una leggera pressione positiva per "pulire" la superficie della cellula (questo soprattutto quando fai patch clamp su fettine di tessuto) e in seguito si applica la pressione negativa per "succhiare" la patch di membrana.
Citazione:
In questo modo io riuscirò a studiare le correnti che fluiscono attraverso i pochi (o meglio ancora, attraverso l' UNICO) canale presente nella piccola area del patch che ho isolato.
Ok. Questo viene in generale chiamato "single channel recording". Il numero di canali che hai è ovviamente dipendente dalla grandezza della micropipetta che usi!
Citazione:
La corrente ionica (dovuta al flusso degli ioni attraverso il canale isolato) viene raccolta dal microelettrodo e inviata all' ingresso invertente (cosa significa "ingresso invertente"?) di un amplificatore differenziale (non è altro che un convertitore corrente- differenza di potenziale che fornisce all'uscita una differenza di potenzile direttamente proporzionale all'intensità di corrente che ha ricevuto).
Tramite un generatore esterno regolabile, si può applicare un POTENZIALE DI COMANDO al secondo ingresso NON INVERTENTE (?) in modo da poter bloccare il potenzile di membrana nell'area del patch (non ne sono sicuro, ma in teoria io blocco il potenziale della membrana nel patch, in modo da poter avere un continuo flusso di ioni attraverso il canale e quindi una continua corrente elettrica che verrà poi raccolta dal microelettrodo, giusto?).
Non ho la più pallida idea di cosa siano gli ingressi invertenti o non invertenti (immagino si tratti di qualche caratteristica dell'elettronica dell'amplificatore). L'idea è comunque quella di considerare la tua cellula come un circuito, con una certa resistenza R. Vale quindi la legge di Ohm dV = R * dI
Quindi tu puoi:
a) imporre una certa corrente (current clamp) e misurare il voltaggio
b) imporre un certo voltaggio (voltage clamp) e misurare la corrente
Se vuoi approfondire il discorso consiglio:
COUNTING CHANNELS: A TUTORIAL GUIDE ON ION CHANNEL FLUCTUATION ANALYSIS
"The Axon Guide": http://www.moleculardevices.com/pages/instruments/axon_guide.html
Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. (per vedere altre applicazioni)
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Nuovo Arrivato
45 Messaggi |
Inserito il - 17 settembre 2009 : 11:36:15
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Innanzitutto grazie davvero Chick... Sempre gentilissimo ed esauriente.
Nelle dispense che io ho c'è scritto: "Mediante un generatore esterno regolabile applico un potenziale di comando in modo da bloccare il potenziale di membrana nell'area del patch. Sarà così possibile miscurare il flusso ionico attraversoi un singolo canale e ottenere, poi, la curva corrente/tensione, la cui pendenza corrisponderà alla conduttanza dei singoli canali".
Se non ho mal capito quindi io applico un potenziale alla membrana per bloccare il suo potenziale; ciò lo faccio in modo tale da avere un flusso continuo di ioni?
Grazie ancora e scusa la cocciutaggine... :-) |
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Gabriele D'Annunzio |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 17 settembre 2009 : 13:30:29
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Come dicevo sopra, imponi un voltaggio e misuri la corrente. Siccome per la legge di Ohm V = R * I e R è costante (dipende essenzialmente dal numero e dal tipo di canali nella regione all'interno della pipetta), allora misurando I puoi trovare R.
La conduttanza è poi definita come l'inverso della resistenza. Ovviamente dovrai imporre un voltaggio opportuno per far aprire il canale (se è voltaggio dipendente) e generare l'opportuno gradiente elettrochimico in modo che gli ioni possano passare. |
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45 Messaggi |
Inserito il - 19 settembre 2009 : 11:38:48
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Perfetto... Proprio quello che cercavo.
Grazie davvero chick80 ! |
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Gabriele D'Annunzio |
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