| Autore |
Discussione |
|
|
lora
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
 Inserito il - 04 dicembre 2009 : 10:16:28
|
|
Salve, vi scrivo perchè avrei bisogno di un consiglio. Devo fare uno studio sulle cellule, ma non ho molta esperienza perchè fino ad ora ho lavorato su altre cose...Ho una linea di cui non so quale sia l'andamento della crescita so solo che è una linea di cellule tumorali non particolarmente aggressiva. Devo vedere se viene captata una particolare sostanza a diverse concentrazioni dopo 3 ore, 24 ore, 48 ore e 72 ore di trattamento con tale sostanza. La domanda è questa: devo seminare lo stesso numero di cellule e vedere quanta sostanza è stata assorbita dopo le rispettive ore, oppure seminare un numero diverso di cellule per fare in modo che alla fine delle 3 ore, 24 ore, 48 ore e 72 ore abbia lo stesso numero di cellule e fare quindi il paragone fra le varie ore con lo stesso numero? Non so se mi sono spiegata bene...Inoltre volevo sapere se posso usare le T75 perchè ho bisogno di un bel pellet alla fine delle varie ore e in questo modo riuscirei a seminare più cellule anche a 3 ore e ad avere quindi un buon pellet alla fine delle 3 ore. Ringrazio molto in anticipo chiunque mi risponda. Buona giornata
|
|
|
|
|
la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2009 : 23:44:03
|
| se devi vedere solo che la sostanza venga captata e questa non ha effetto tossico sulle cellule a 3 ore dal trattamento o 72 ore avrai sempre un buon numero di cellule, cambierà la quantità di sostanza captata. Generalmente non piastri le cellule e le tratti subito, aspetti almeno 24 h perchè aderiscano al supporto e inizino a crescere e poi procedi col trattamento, puoi usare le 6 well-plate o le flask dipende dal quantitativo minimo di cellule che ti servono..io comunque seminerei lo stesso quantitativo di cellule e andrei a valutare la captazione di questa sostanza ai diversi tempi, certo che dovresti tenerti un po' in coltura la linea per vedere quanto e come cresce, sennò rischi di mandarla in overconfluenza |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
 |
|
|
lora
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
Inserito il - 11 dicembre 2009 : 16:01:37
|
| Ciao, grazie per avermi risposto. In questi giorni ho provato a fare diverse semine per capire la crescita di queste cellule.Volevo chiederti dei chiarimenti riguardo la conta . Io uso la camera di burker. Quando la fiasca raggiunge più o meno la confluenza, stacco le cellule e le sospendo in 5ml di terreno. Spipetto bene e poi pesco 10microlitri di sospensione, 10microlitri di acqua e li mescolo, facendo quindi una diluizione 1:2; di questa ne prelevo 10microlitri e li carico nella burker.In questo modo riesco a contare le cellule bene. Ma è corretto come sto facendo? In genere conto 9 camere e poi faccio la media. Ho letto che per fare una buona sospensione il numero di cellule per camera deve essere simile. E' giusto sospendere in 5ml? E' giusto prelevare 10microlitri per fare la diluizione o è poco?C'è un numero minimo di cellule che deve essere contato nelle singole camere per essere una buona conta? Sono alle prime armi e non mai visto fare da nessuno questi passaggi...Grazie per l'aiuto |
|
|
|
la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 11 dicembre 2009 : 21:20:35
|
di acqua..? la diluizione 1:2 io la faccio prendendo 10 ul di sospensione cellulare e 10 di Trypan Blue, non serve contare 9 campi come non serve risospendere 5 ml, dipende da quante cellule hai da quanto sono grandi ecc, se sono in flask da 75 da 25 da 150! Ci fai l'occhio col tempo ma io in base al pellet che ho dopo aver tripsinizzato e centrifugato risospendo in 1-2-3 ml, all'occorrenza poi si diluisce ulteriormente l'aliquota da 10 ul pescata..in genere devi risospendere le cellule in un volume che ti permetta di non vedere nella camera di Burker nè 5 cellule ne 500 a campo, o gruppi di cellule appiccicati, perchè sennò la tua conta non è precisa |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
|
|
|
lora
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
Inserito il - 13 dicembre 2009 : 18:28:59
|
| Il Trypan Blue è propio necessario? Io sapevo che veniva usato per poter distinguere le cellule vive da quelle morte. Scusa l'ignoranza ma per campo intendi per camera? (una camera è delimitata da tre righe e contiene 9 quadrati delimitati da due righe no?)Io uso le fiasche da 25. Come mi consiglieresti di procedere? Quale sarebbe il numero giusto per camera da contare? E' vero che per essere una buona sospensione dovremmo avere più o meno lo stesso numero di cellule per camera? Ti ringrazio tanto |
|
|
|
Simona84
Utente Junior
Città: milano
131 Messaggi |
Inserito il - 13 dicembre 2009 : 19:08:57
|
il conteggio col trypan blue è necessario perchè se banalmente usi due flasks diverse possono avere una percentuale di vitalità differente e il numero di cellule vitali ce andrai a seminare sarà differente, introducendo una variabile d'errore già nel primo step del tuo esperimento!per il conteggio alla camera di burker si può fare in diversi modi... io personalmente conto 12 quadratini in diagonale e quando voglio essere sicura conto anche l'altra...però come ho detto rima si può fare anche in modi differenti...
ciao! |
|
|
|
lora
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
Inserito il - 14 dicembre 2009 : 11:53:12
|
| Grazie. In quanto volume sospendi il pellet per fare la conta? Quante cellule conti per quadratino? Fai una diluizione della sospensione?Buona giornata |
|
|
|
la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 14 dicembre 2009 : 19:48:26
|
se non sai quante cellule VIVE piastri per ogni split non potrai mai fare una curva di crescita corretta..  comunque come ho scritto all'inizio non si può stabilire un volume in cui risospendere il pellet, se hai 300.000 cellule o 30milioni i volumi sono diversi! Per me una buona diluizione è quella per cui per ogni campo/"quadratone"/camera che dir si voglia ci sono un centinaio di cellule, e ne conto 3 in diagonale, o 2 ai due estremi della camera di Burker. Tecnicamente se la tua risospensione è avvenuta correttamente (compresa anche la diluizione 1:2 e l'atto pratico di metter i 10 ul nella camera) le cellule sono distribuite nella camera in maniera omogenea |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
|
|
|
lora
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
Inserito il - 15 dicembre 2009 : 13:18:08
|
| Ok ti ringrazio molto..., ci provo .Buona giornata |
|
|
|
Shasa
Nuovo Arrivato
12 Messaggi |
Inserito il - 17 dicembre 2009 : 11:54:24
|
| ciao a tutti!!Ho fatto una coltura di linfociti con diversi stimoli di Concavalina A e ho messo la piastra ad incubare per 48 ore. Per valutare la proliferazione cellulare userò la timidina triziata: il protocollo dice di mettere la timidina a 44 ore e non a 48, sapete dirmi perchè?? ringrazio chi vorrà rispondermi...buona giornata |
|
|
| |
Discussione |
|
colture cellulari
Didattica e Relazioni
